枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质.pdfVIP

中国水产科学 2017 年 11 月, 24(6): 12881297 Journal of Fishery Sciences of China 研究论文 DOI: 10.3724/SP.J.1118.2017.17129 枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质 1, 2 1 3 3 杨光 , 盛军, 陈亚东, 沙珍霞 1. 中国水产科学研究院 黄海水产研究所, 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室, 山东 青岛 266071; 2. 上海海洋大学 水产与生命学院, 上海 201306; 3. 青岛大学 生命科学学院, 山东 青岛 266071 摘要: 构建了枯草芽孢杆菌CH2 菌株(Bacillus subtilis CH2)壳聚糖酶基因的真核表达载体pPIC9K-CH2-Cns, 在毕 赤酵母 GS115(Pichia pastoris) 中进行重组表达, 获得了有生物学活性的重组壳聚糖酶, 对重组壳聚糖酶的酶学特 性及酶解产物进行了分析。结果显示, 重组壳聚糖酶的分子量为29 kD, 粗酶的比酶活达到 133.60 U/mg, 纯化后重 组蛋白的比酶活为 338.08 U/mg; 该酶的最适作用温度为 50 ℃, 最适 pH 为 4.5, 酶动力学常数 V =24.39 (μmol/ max 1 2+ + 2+ + 2+ mg)·min , Km=5.48 mg/mL; Fe 、K 等对其酶活力有一定的激活作用, 其中Mn 能使酶活力提升2.4 倍, Ag 、Mg 、 Hg2+ 、EDTA 、EGTA 和SDS 等存在时则对其酶活力有强烈抑制作用。利用重组壳聚糖酶酶解壳聚糖, 酶解产物主 要为聚合度2~10 的壳寡糖, 且分布均匀。以上结果表明, 枯草芽孢杆菌CH2 菌株壳聚糖酶基因在毕赤酵母GS115 中成功表达, 获得了一种内切型的高酶活力重组壳聚糖酶, 该重组酶具有反应条件温和、酶解产物均一等特点, 可 被应用于海洋甲壳质加工应用中。 关键词: 壳聚糖酶; 枯草芽孢杆菌CH2 菌株; 壳寡糖; 毕赤酵母; 酶学性质 中图分类号: S96 文献标志码: A 文章编号: 10058737(2017)06128810 自20 世纪70 年代发现壳聚糖酶(chitosanase, 涵体形式表达, 重组壳聚糖酶生物酶活力低, 而 [1] Csn) 以来 , 壳聚糖酶已逐步成为海洋活性壳寡 且原核表达的背景蛋白过多, 重组壳聚糖酶分离 糖制备的首选[25] 。目前, 对细菌、真菌、植物等 纯化复杂, 这些缺点导致原核表达的壳聚糖酶无 [1316] 壳聚糖酶的研究更多还是集中在对产壳聚糖酶微 法实现大规模的工业化生产 。 生物筛选和产酶条件优化上[67] 。壳聚糖酶虽是目 毕赤酵母表达系统是近几十年来迅速发展起 前生产制备壳寡糖的理想酶制剂, 但是野生型产 来的新型外源蛋白表达系统, 可实现外源蛋白的 酶菌株来源有限, 对目标菌株的筛选工作量大、 高效分泌