试验设计绿色荧光蛋白的表达.docVIP

分子生物学实验设计报告 绿色荧光蛋白的克隆表达 ——闵霞（2013141241165） 李彩云（2013141241095） 引言 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而广受科学家们的关注。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的。 1、仪器 恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台， 10、100、1000μL取液器各一支， 台式高速离心机，制冰机，漩涡器。 2、材料： 含有质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a的大肠杆菌DH5α 1.5ml塑料离心管 EP管架 微量取液器和取液器吸头 常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、试剂瓶等） 3、试剂 LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g，琼脂（固体培养基）15g，用 1N NaOH调pH 7.5。 溶液 Ⅰ，溶液 Ⅱ，溶液 Ⅲ 氨苄青霉素(50mg/mL) 抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ） 作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离。平衡酚密度大，可是DNA在上清中。异戊醇防止抽提液起泡。 无水乙醇 作用：除去DNA水化层，使DNA沉淀。 70%乙醇 作用：纯化质粒DNA。 TE缓冲液或ddH2O 作用：溶解DNA 详细步骤 1.1质粒扩增 在含有质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a的大肠杆菌DH5α平板菌落上挑取单菌落，分别接种于液体培养基中（加氨苄青霉素40μg/mL），180 r/min振荡培养过夜 1.2碱裂解法提取质粒 1）取各培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液。 2）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min。 3）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min。 4）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，盖紧后，温和颠倒3-5次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min。 5）10000rpm× 5 min，取上清液于另一干净的离心管中。 6）向上清液中加入等体积（约400μL）酚：氯仿/异戊醇（25：24：1，v/v），振荡混匀，10000rpm × 10 min，将上清液转移至新的离心管中。 7）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，10000rpm × 2min ,取上清液于新离心管中。 8）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀， -20℃放置1h。 9）12000rpm × 5 min，倒去上清液，吸干液体。 10）加800μL70%乙醇，离心12000rpm × 1 min，倒尽上清液，吸水纸吸干液体，室温自然干燥30min，直至变得透明无乙醇味。 11）加20μL ddH2O（二次蒸馏水） ，混匀使DNA溶解完全，取5μL做电泳检测，剩余的溶液放置-20℃保存备用。 实验结果预测：加入溶液1浑浊；加入溶液2变澄清；加入溶液3出现白色絮状沉淀；加入氯仿抽提溶液分层 若成功提取，需琼脂糖凝胶电泳检测之后才能观察出结果。 2、琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA 实验原理 质粒DNA在细胞内有三种构象：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；③线状DNA，双链DNA断开成线状。电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。因此在本实验中，质粒在电泳中呈现2~3条区带。 实验目的 检验是否获得所需的质粒 实验用品 1、仪器 电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。 2、材料： 提取的质粒，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，剪刀，取液器吸头。 3、试剂： Gold view（DNA染料） 1×TAE缓冲液 上样缓冲液（6×） 详细步骤 2.1琼脂糖凝胶板制备 1）称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL1×TAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。 2）待胶液冷却到65℃（不烫手为宜），加入1μL Gold view混匀，搅拌器上搅拌排除气泡，（如右图）缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子 ）内 。静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子。 2.2加样 胶板放入电泳槽