《免疫组织化学在皮肤科中的应用》.ppt

免疫组织化学在皮肤科中的应用 免疫组织化学概论（Immunohistochemistry） 定义： 又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，为确定某一特定物质在组织内的局部定位，使用以目的物作为抗原的特异性抗体进行检测的方法，即免疫组织化学(简称免疫组化)。 原理 其主要原理是用荧光素、生物素或地高辛 等标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内 的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或 定量检测，经过组织化学的呈色反应之 后，用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜 观察。 免疫组化的技术分类 免疫组化的方法有直接法和间接法： 直接法直接标记特异性抗体； 间接法不直接标记特异性抗体，一般标记免疫球蛋白，将被标记的免疫球蛋白再结合到特异性抗体上。 免疫组化技术常用方法按标记物种类可分为：免疫荧光法、免疫酶法、免疫金属技术、亲和免疫组化技术以及免疫电镜技术等。 常用标记物 荧光素：最常用的是异硫氰酸荧光素（FITC） —— 荧光显微镜下呈绿色荧光；四乙基罗达明（RB200）——荧光显微镜下发橙红色荧光；使用荧光显微镜观察上述荧光标记物（荧光抗体法）。 辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素等：运用普通光学显微镜观察的标记物。 铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 免疫组化在皮肤病理中的应用 凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原、病原体等均可用免疫组织化学方法显示。 免疫组化在皮肤病理中的作用主要是鉴别组织类型或细胞来源，在淋巴细胞增生疾病中，免疫组化可在其克隆方面提供信息，有助于判断细胞的良恶性来源。 亲和免疫组织化学技术 70年代以来，免疫组织化学在技术方法上不断改进，涌现了一批新的技术方法，其特点为一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素（Lectin）、生物素（Biotin）、亲和素（avidin）和葡萄球菌A蛋白（SPA）等被应用于免疫细胞化学技术，从而建立了SPA—HRP法、ABC法、BRAB法和LAB法等。 其共同特点是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础，其本质上又非抗原抗体反应。因此，Bayer（1976）首次称之为亲合组织化学。事实上，抗原抗体反应从本质上也属于亲合组织化学这一范畴。 目前，亲合组织化学包括抗原与抗体、植物凝集素和糖类、生物素与抗生物素、葡萄球菌A蛋白与IgG、阳离子与阴离子、激素、维生素、糖及类脂质作用部位和受体等。 亲合细胞化学引入免疫细胞化学后使其敏感性得到进一步提高，因此更有利于微量抗原（或抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，从而出尽了免疫组化技术的发展和亲和免疫组化的创立。 亲和素与生物素系统 1、亲和素 是一种碱性糖蛋白，分子量为68000，具有4个同维生素H亲合力极高的结合点。一般从蛋白清中提取，故又称卵白素。 2、维生素H（以下统称生物素） 是一种小分子的维生素，与卵白素之间有极强的亲合力，较之抗体对抗原亲合力要高出100万倍，能彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性。 注：生物素与卵白素都具有与其它示踪物质如荧光素、铁蛋白和过氧化物酶等相结合的能力。利用上述特性，建立了卵白素—生物素免疫染色系统，即亲和素—生物素免疫染色法。 3、链霉亲和素 是一种从链霉菌培养物中提取的蛋白质，相对分子量60000，且不含糖链。同亲和素一样，具有4个生物素结合位点，亲和力高达10-15mol/L，是一种更完美的生物素结合蛋白。 优点：很少有低聚糖残余成分，可保持中性等电点，避免了组织中的非特异性染色。 借助此特点建立了亲和素—链霉免疫染色法。 基本原理 近年来，亲和免疫组化技术不断创新，目前为止拥有标记亲和素-生物素技术（LAB）、桥亲和素-生物素技术（BAB）、亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法（ABC）以及链霉亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法（SP）等。 1．LAB法 以生物素标记抗体作第一抗体，过氧化物酶标记亲和素作为第二抗体（见图）： BAB法 把两者连接起来先用生物素标记的抗体与细胞/组织内的抗原反应，洗去未结合的抗体，加入抗生物素孵育后，洗去未结合的抗生物素，再加入已标记酶的生物素孵育，洗片以细胞化学方法呈色反应（见图）。 ABC法 （1）ABC复合物的制备： SP或SAP法 即过氧化物酶标记的链霉卵白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色。 反应原理 SP或SAP法 该法是ABC法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合过氧化物酶 。它有4个亚基可与生物素结合，灵敏特异，背景低，成本低。 优点：更简便，放大倍数↑，等电点中性更适合组织，分子量小，穿透力↑。 （三）染色步骤（SP法为例） 每份组织均切3μm的薄片,于60℃烤箱烤片6h以上备用。具体步骤如下： 人体常见细胞的免疫组化特性 淋巴细胞