生化试验1经典案例.ppt

生态学实验： 一、种群密度的调查 1、总数量计算法：大型、明显易见的生物 2、样方法 3、标志重捕法 4、移除法：短期内用同一方法陆续取走一部分动物，把每次取走的动物数量累加起来，并作图，看出被取走的动物总数会稳定在一定数量。 二、水质污染的微核检测法 实验原理：蚕豆染色体少（6对），形体大。蚕豆发芽时对诱变剂敏感，易出现微核现象 步骤：1、采集水样 2、催芽至根须长2-3cm 3、染毒 4、复培：将染毒后的根重新培养 5、制片观察 结果：根据微核的数量来判断污染物的毒性 水中污染物的检测 溶解氧（DO）：衡量污染程度的指标 碘量法：原理：水样中加入硫酸锰及碘化钾生成氢氧化锰沉淀，与水中溶解氧生成锰酸锰，再加入浓硫酸，使已化合的溶解氧与碘化钾发生反应析出碘。溶解氧越多，析出的碘越多，溶液颜色越深。用淀粉作指示剂，用硫代硫酸钠滴定碘含量，计算出溶解氧的含量。 步骤：采集水样；定氧；滴定 物种分布及多样性调查 一、土壤中动物的分布调查 1、选择三种类型的土壤环境 2、每种土壤挖三个样方：0.25×0.25×0.3m3 3、分别统计1-10cm层、11-20cm层、21-30cm层的动物种类及其数量 4、需测定土壤的温度和酸碱度 结果分析：求出每种土壤类型的不同层次中动物数量的平均值、标准差、标准误 比较不同土壤动物种类和密度，说明环境条件 生化试验 一、实验仪器 1、微量移液器：枪 一般五种规格，范围：0.5微升-5ml 2、水浴锅 3、琼脂糖水平电泳槽 4、快速混匀器 5、离心机 6、稳压稳流电泳仪 7、酸度计 8、PCR扩增仪 二、层析技术 1、吸附层析：把吸附剂装入玻璃柱内，由于吸附剂对不同物质的吸附力不同，在洗脱过程中会因移动速度不同而逐渐分离出来。 常用来分离：非极性和极性不强的有机物 2、分配层析：利用混合物中各组分在两相中的分配系数不同而达到分离目的。（纸层析法） 固定相：极性溶液 流动相：有机溶剂 Rf=溶质层析点中心到原点中心的距离 溶剂前沿到原点中心的距离 固定相 流动相 3、离子交换层析：利用离子交换剂对需要分离的各种离子具有不同的亲和力而达到分离目的。 固定相：离子交换剂 流动相：电解质溶液 离子交换剂：阳离子交换剂；阴离子交换剂 洗脱常用：电解质浓度梯度；pH梯度 4、凝胶过滤：利用具有一定孔径范围的多孔凝胶的分子筛作用对生物大分子进行分离。 5、亲和层析：利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物（配体）连接到某种固相载体上，并将装有配体的固相载体装柱，当大分子蛋白通过时会特异性结合，其他则被冲洗下去 三、电泳技术 1、泳动率=Ld/Vt L：泳动距离d：支持物的有效长度；V：电压 t：通电时间 泳动率与球形分子所带电荷电量成正比；与分子大小及介质黏度成反比。 pH小于等电点，分子带正电，向负极泳动；pH偏离等电点越远，分子所带电荷越多，涌动越快。 缓冲液的离子浓度过高，离子的电泳速度减慢； 缓冲液的离子浓度过低，不易维持pH稳定 2、醋酸纤维素薄膜电泳：利用醋酸纤维素薄膜做固体支持物。用于蛋白质、酶的分离。 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖不含带电荷的集团，通过氢键形成凝胶，电泳速度快，区带整齐。主分离DNA 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）:分离蛋白质和核酸 三、生物大分子分离 1、细胞破碎：捣碎法、研磨法、匀浆法、冻融法、超声波处理、压榨法、酶解法 2、提取：盐溶液、缓冲液、有机溶剂 3、纯化：沉淀法、透析、超滤、冷冻干燥 生物大分子的分离、纯化、鉴定 细胞及其组分的分离和纯化 从组织中分离出不同类型的细胞 方法：用蛋白水解酶和钙螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）处理组织，再轻度机械破坏，使之成为单细胞。 用超速离心机分离出细胞器和大分子 方法:见图 聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA PCR进行的基本条件：DNA模板、引物、dNTP、TaqDNA酶、反应缓冲体系（Mg2+） PCR三个步骤： 1、模板DNA变性：94度变成单链 2、模板DNA和引物的复性（55度） 3、引物的延伸 引物设计：15-25个核苷酸；G+C（40%-60%）；Tm=55度；引物自身形成环结构的碱基对﹤3；两条引物配对碱基数小于5 分光光度计 原理：光线选择性的被溶液吸收，不同浓度吸光不同 对于相同物质和相同波长的单色光来说，溶液的光密度与溶液浓度呈正比。C1=D1×C2/D2 C2:标准溶液的浓度； 步骤：事先测定一系列不同浓度的标准管，然后以光密度对标准浓度作图，得到标准曲线，测得待测物质的光密度后，从标准曲线上查到相应的浓度数值。 用分光光度计测叶绿体中各色素的含量 1、提取叶绿素 2、测定吸光度 3、根据公式计算出叶绿素的浓