生物化学 蛋白质分离纯化 张洪渊方法技巧.ppt

一、一般原则及基本步骤 材料的预处理及细胞破碎 蛋白质的抽提 蛋白质的粗分级 等电点沉淀法 盐析法 有机溶剂沉淀法 蛋白质的细分级 凝胶层析法 离子交换层析法 亲和层析 第六节 蛋白质的分离纯化与测定 二、蛋白质的分离纯化方法 ◇（一）根据分子大小不同的纯化方法 ◇（二）利用溶解度差别的纯化方法 ◇（三）根据电荷不同的纯化方法 ◇（四）利用选择性吸附的纯化方法 ◇（五）利用配体的特异性亲和力的纯化方法 （一）根据分子大小不同的纯化方法 ◇ 1.透析和超滤 ◇ 2.密度梯度离心 ◇ 3.凝胶过滤 1.透析和超滤 半透膜袋 蛋白质溶液 透析液 磁棒 磁力搅拌器 透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。常用的半透膜： ?玻璃纸（赛璐玢纸，cellophane paper） ?火绵纸（赛璐玎纸, celloidin paper） ? 其他改型纤维素材料 超过滤（ultrafiltration） 利用压力、抽滤（A）或离心力（B）等多种形式，强行使水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐目的。滤膜有多种规格，可选择性的截留相对分子量不同的蛋白质。 为了避免被膜截留的蛋白质在膜表面上堆积，现常用截向流过滤的方法，即液体在泵驱动下沿着与膜表面相切方向流动，在膜上形成压力，使部分液体透过膜，而另一部分液体切向地流过表面将被膜截留的蛋白质分子冲走。 滤膜 抽气 滤膜 离心 A B 2.密度梯度离心法（density gradient） 生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有蔗糖、氯化铯等。 滴加样品 离心管 蔗糖密度梯度 蔗糖浓度 3.凝胶过滤 原理： 凝胶层析也称为排阻凝胶层析、凝胶过滤和分子筛层析。它是60 年代发展起来的，利用凝胶把物质按分子大小不同进行分离的一种方法。由于被分离物质的分子大小（直径）和形状不同，洗脱时，大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层析柱，而小分子物质，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔，使之洗脱时流程增长，移动速度慢而后流出层析柱。 应用 测定分子量 分子筛层析原理示意图 蛋白质Mr=49,000 洗出液中的蛋白质浓度 洗脱体积（mL） 未知 logMr 洗脱体积与相对分子质量的关系 Andrews的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo) 球蛋白Mr“ 选择性曲线” G-200 G-100 logMr Kav （二）利用溶解度差别的纯化方法 ◇ 1.等电沉淀和PH控制 ◇ 2.蛋白质的盐溶和盐析 ◇ 3.有机溶剂分级分离 ◇ 4.温度对蛋白质溶解度的影响 1.等电沉淀和PH控制 蛋白质处于等电点。其他条件相同时，它的溶解度达到最低点。在等电点以上或以下的pH时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而相互排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。在其等电点(pH 5.2-5.3)时达到最低值，在等电点两侧的pH下，其溶解度迅速上升；不同的蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。 当pH被调至蛋白质混合物中某种成分的等电点pH时，这种蛋白质的大部分或全部将沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中这样沉淀出来的蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 2.蛋白质的盐溶和盐析 低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶(salting in), 盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度增高。 球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。 盐析？ 3.有机溶剂分级分离 （1）有机溶剂可以使蛋白质沉淀 主要有乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。 （2）有机溶剂可以破坏水化膜、造成一个低介电区。 （3）有分级分离现象 （4）要求对有机溶剂低温预冷。 4.温度对蛋白质溶解度的影响 在一定温度范围内，约0-40℃之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但也有例外，例如人的血红蛋白从0到25℃，溶解度随温度上升而降低。在