抗xa与抗iia活性检测方法标准规范操作规程.docVIP

一、USP方法 5.2.12抗IIa活性（20.0~35.0IU/mg） 5.2.12.1仪器：紫外可见分光光度计、低温循环槽、电子天平 5.2.12.2试液： 醋酸溶液：取冰乙酸42ml于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。 pH7.4聚乙二醇6000缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷6.08g和氯化钠8.77g于1000ml容量瓶中，加水500ml溶解后，加聚乙二醇6000 1.0g，用盐酸调节pH至7.4，加水稀释至刻度。 pH7.4缓冲溶液：称取三羟甲基氨基甲烷6.08g和氯化钠8.77g于1000ml容量瓶中，加水500ml溶解后，用盐酸调节pH至7.4，加水稀释至刻度。 pH 8.4缓冲溶液：称取三羟甲基氨基甲烷3.03g、氯化钠5.12g和乙二胺四乙酸二钠1.40g于500ml容量瓶中，加水250ml溶解后，用盐酸调节pH至8.4，加水稀释至刻度。 抗凝血酶III溶液：取1支抗凝血酶III，加水溶解成5Units/ml。用pH7.4聚乙二醇6000缓冲液稀释成0.5Unit/ml。 人凝血酶溶液：用水将人凝血酶复溶，用pH7.4聚乙二醇6000缓冲液稀释成5Units/ml。 显色底物：选择适合凝血酶的阿米酚试验的显色底物，用水稀释成浓度约3mmol/L。临用前用pH 8.4缓冲溶液稀释至0.5 mmol/L。 标准溶液：用pH 7.4缓冲溶液将USP依诺肝素钠活性标准品稀释为浓度0.015~0.070USPIU/ml之间的四个浓度梯度。 样品溶液：用pH 7.4缓冲溶液将依诺肝素钠样品稀释为与标准溶液浓度一致的浓度梯度。 5.2.11.3检测过程：取18支检测管，B1、B2为空白；T1、T2、T3、T4为样品溶液，各双份平行；S1、S2、S3、S4为标准溶液，各双份平行。按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2的顺序，每管中加入抗凝血酶III的体积为V（20~50μl），和同样体积的pH 7.4缓冲溶液（空白）、标准溶液或样品溶液；混合，但不要产生气泡。于37℃温浴1分钟。向每管中加入2V人凝血酶溶液（40~100μl），温浴1分钟。再加入5V显色底物（100~250μl），4分钟后加入5V的醋酸溶液（100~250μl）终止反应。以B1为空白，用紫外可见分光光度计在405nm处测量光吸收。空白B2的吸收值相比B1不得超过±0.05。 5.2.12.4计算 对每个浓度系列，将光吸收回归，与样品溶液和标准溶液的浓度对数值作线性分析。然后以量平行线分析统计方法计算每mL中依诺肝素钠抗IIa因子IU活性。4个浓度溶液的计算值组合计算得到最终的平均值，然后计算可信限度。抗IIa因子用IU/mg表示，按干品计。两人结果的相对平均偏差不得超过5.0%。 5.2.13抗Xa因子活性（90~125IU/mg） 5.2.13.1仪器：紫外可见分光光度计、低温循环槽、电子天平 5.2.13.2试液： 醋酸溶液、pH7.4聚乙二醇6000缓冲液、pH7.4缓冲溶液、pH 8.4缓冲溶液同抗IIa因子检测。 抗凝血酶III：取1支抗凝血酶III，加水溶解成5Units/ml。用pH7.4聚乙二醇6000缓冲液稀释成1.0Unit/ml。 Xa因子溶液：用pH7.4聚乙二醇6000缓冲液稀释，使之在下述检测中405nm处光吸收每分钟增加不超过0.20，但要用体积为V的 pH7.4的缓冲液代替依诺肝素钠溶液。 显色底物：选择适合Xa因子的阿米酚试验的显色底物，用水稀释成浓度约3mmol/L。临用前用pH 8.4缓冲溶液稀释至0.5 mmol/L。 标准溶液：用pH 7.4缓冲溶液将USP依诺肝素钠活性标准品稀释为浓度0.076~0.180 USP IU/ml之间的四个浓度梯度。 样品溶液：用pH 7.4缓冲溶液将依诺肝素钠样品稀释为与标准溶液浓度一致的浓度梯度。 5.2.13.3检测过程：取18支检测管，B1、B2为空白；T1、T2、T3、T4为样品溶液，各双份平行；S1、S2、S3、S4为标准溶液，各双份平行。按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2的顺序，每管中加入抗凝血酶III的体积为V（20~50μl），和同样体积的pH 7.4缓冲溶液、标准溶液或样品溶液；混合，但不要产生气泡。于37℃温浴1分钟。向每管中加入2VXa因子溶液（40~100μl），温浴1分钟。再加入5V显色底物（100~250μl），4分钟后加入5V的醋酸溶液（100~250μl）终止反应。以B1为空白，用紫外可见分光光度计在405nm处测量光吸收。空白B2的吸收值相比B1不得超过±0.05。 5.2.13.4计算 对每个浓度系列