产胸苷磷酸化酶菌株初筛方法的建立及其应用-生物通.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３４（１２）：７８８３ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 产胸苷磷酸化酶菌株初筛方法的建立及其应用 １ １ １ ２ 陈宝珍 　李红梅 　王伟洁 　陈群毅 （１上海理工大学 医疗器械与食品学院　上海　２０００９３　２厦门毅和立生物科技有限公司　厦门　３６１００７） 摘要　建立了一种快速简便地筛选高产胸苷磷酸化酶菌株的初筛方法及其在紫外诱变育种中的 应用。结果显示，在液体培养基中，添加２５ｍｍｏｌ／Ｌ胸苷不会影响菌体生长且菌体中的胸苷磷酸 化酶能催化胸苷生成胸腺嘧啶，在同等浓度下产物胸腺嘧啶ＯＤ 远大于胸苷ＯＤ ，从而导致 ２９０ｎｍ ２９０ｎｍ 发酵液ＯＤ 显著升高，据此建立产胸苷磷酸化酶短乳杆菌的初筛方法。在此基础上结合紫外诱 ２９０ｎｍ 变条件的优化，确定初次紫外照射时间为２０ｓ，停止５ｍｉｎ后再照射１０ｓ、１５ｓ、２０ｓ，控制紫外致死 率在８０％左右，以此条件构建突变文库。通过初筛和复筛确定突变株 ＥＢ 、ＥＡ 酶活分别达到 ２７ ４２ １．０２５Ｕ／ｍｇ湿菌体和０．９１６Ｕ／ｍｇ湿菌体，较初始菌株提高了５０％和３５％，且具有良好的遗传稳 定性。 关键词　短乳杆菌　初筛方法　紫外诱变　胸苷磷酸化酶 中图分类号　Ｑ５５　Ｑ５２５ ［１１］ 　　胸苷磷酸化酶广泛存在于动植物器官及微生物体 的乳酸菌；刘畅等 通过紫外诱变处理筛选出一株酸 内，是生物体内嘧啶核苷补救途径中的关键酶，也是体 性蛋白酶缺陷菌株较原始菌株活力提高了３．７％。目 ［１］ 外酶法合成核苷类物质的重要酶 。胸苷磷酸化酶对 前产核苷磷酸化酶菌种的传统选育主要是随机筛选 脱氧核苷具有很高的底物特异性，能可逆催化胸苷去 法，该方法主要通过破胞后，采用紫外分光光度法和高 磷酸化，生成胸腺嘧啶和２脱氧核糖１磷酸，是生物合 效液相色谱法，测定核苷磷酸化酶的活力来确定菌种 ［２３］ 成５ＦＵ前体药氟铁龙和希达罗的关键酶 。由于酶 优劣。但该方法费时费力，靶向性不高，因此建立合 法合成核苷具有专一性强，工艺简单，反应条件温和， 理、高效、快速的筛选方法进行定量预测是非常重要 成本低且不易造成环境污染等优点，故酶法合成核苷 的［１２１４］。本研究以短乳杆菌为出发菌株，确定初筛培 ［４］ 日益受到关注 。目前生产核苷磷酸化酶类主要是通 养基主要成分的基础上，基于紫外分光光度法测定胸 过微生物发酵法，因此筛选获得具有优良性能的工业 苷磷酸化酶活力，结合传统的紫外复合诱变方法，快速 微生物是酶法合成核苷物质的关键。 有效地筛选胸苷磷酸化酶高产菌株。 　　工业微生物菌株多是通过传统随机诱变与合理的 ［５］ １　材料与方法 筛选得到 。其中紫外诱变育种是最常用的传统诱变 技术之一，２６０ｎｍ的紫外辐射是最有效的诱变剂，可使 １．１　材　料 ＤＮＡ分子形成嘧啶二聚体，引起双链结构扭曲变形，阻 　 　 菌 株：短 乳 杆 菌 （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ［６７］