蝉蜕多糖分离纯化.docVIP

蝉蜕多糖的分离纯化 实验目的：掌握多糖的分离纯化方法。 实验原理：根据相似相容的特点，糖类易溶于水，不容于有机溶剂，可用水提醇沉的方法进行提取。采用醇沉法获得的多糖常混有较多的蛋白质，可用盐酸法除去蛋白质。 实验材料 蝉蜕 95％乙醇 盐酸 蒸馏水 电热鼓风干燥箱 粉碎机 冰箱 离心机 圆底烧瓶 试管 实验步骤 预处理 ?拣选蝉蜕清洗除杂3～4次，反复漂洗，直至水澄清。 ?将样品放在报纸上摊开，置于60℃鼓风干燥箱中恒温鼓风加热干燥8h，称重。 ?高速粉碎机粉碎，粉碎后样品过筛备用。 提取（水提醇沉） ?称取蝉蜕药材细粉8g于250mL圆底烧瓶。 ?按固液比1∶20加蒸馏水，回流提取3次，每次1h。 ?合并提取液，浓缩至药液比1∶1，加入95%乙醇至含醇量90%。 ?置冰箱中放置过夜后4500r/min离心15min。 ?取上清液回收干燥，即得蝉蜕90%水提醇沉物残渣干燥，即得醇沉渣。 纯化 取样品浓缩液，用2mol/L盐酸调节其PH 至3，放置过夜，在3000r/min条件下离心，弃去沉淀即脱去蛋白质。 实验观察 预处理后用碱溶液提取法提取蝉蜕多糖。具体方法：将处理后的蝉蜕加入2倍体积的1mol/LNaOH,在100℃水浴中加热1h，过滤收集滤液，在滤渣中加入2倍体积的1mol/LNaOH,在100℃水浴中加热1.5h，过滤收集滤液,重复此操作3次，每次重复分别增加0.5h，最后合并滤液。100℃水浴浓缩至原体积0.2倍，加入3倍体积的冰冻无水乙醇，4℃过夜，6000r/min离心10min弃上清液，沉淀用蒸馏水溶解，沸水浴浓缩，无水乙醇沉淀，离心除去有机溶剂,收集沉淀，50℃干燥至恒重即为蝉蜕多糖。共进行3批次平行实验。 1、?制作标准曲线： ?准确称取105?℃烘干至恒重的葡萄糖50mg于500ml容量瓶中配成0.1?mg/ml?的标准溶液，用蒸馏水分别配成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1?mg/ml。 ?1?ml标准液分别加入?5%?苯酚溶液1?ml，并迅速加入浓硫酸5?ml，静置10?min。 ?摇匀，30℃放置30?min后于490nm测定OD值。 ?以葡萄糖含量为横坐标，OD值为纵坐标，制作得到标准曲线。? 2\?样品含量测定：吸取1.0ml样品液，按照上述步骤操作测定OD490，并代入标准曲线计算样品的总糖含量。 蝉蜕多糖的分离纯化 摘 要 ：目的 ： 本实验是从蝉衣中提取多糖, 并研究蝉蜕多糖的性质。方法 ：将蝉衣去除杂质，使用膜超滤对多糖进行分离提取 9.94％理论氨基的含量 式 中： C1:Hcl溶液的浓度 (mol·I -1 ) ； C2:标准 N a O H溶 液的浓度 ( mol·I -1 ) ； v 1 ：加入的 H C 1溶液的体积 ( m I) ； V 2 ：消耗标准 N a O H溶液的体积( m I) ； G：试样重 ( g ) ； W ：试样含水量 ( ％) ； 0.0 1 6 ：与 l mol·I -1 Hcl l mI相当的氨基量 ( g )。 3.2多糖含量的测定 利用蒽酮硫酸法进行多糖含量的测定． ２ｇ/Ｌ蒽酮试剂的配制：取２ｇ蒽酮溶解到８0％Ｈ２ＳＯ４中，并以８0％Ｈ２ＳＯ４定容到１000ｍＬ，当日配制使用． ０.1ｇ/Ｌ葡萄糖溶液的配制：准确称取标准葡萄糖０.01ｇ，用少量蒸馏水溶解后定容至１00ｍＬ容量瓶中．精密称取０.１ｇ／Ｌ葡萄糖溶液０.10，０.20，０.30，０.40，０.60，０.80ｍＬ至６支试管中，然后将每支试管中溶液用蒸馏水补足至1ml，混匀；加入４.00ｍＬ蒽酮试剂，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起用玻璃球将管口盖住，浸于沸水浴中，自水浴重新煮沸起，准确煮沸10min，取出，流水冷却，室温放置10min左右，测620nm处吸光度值．以蒸馏水作为空白样品对照，以620nm处吸光度值为纵坐标，葡萄糖质量浓度为横坐标，绘制标准曲线 准确称取0.1g蝉蜕多糖，用无菌水配制浓度100?ug/ml的10ml溶液，测定吸光度，计算样品中的多糖含量。 3.3多糖的纯度鉴定 利用超离心法对多糖的纯度进行鉴定，准确称取0.1g蝉蜕多糖，用无菌水配制浓度100?ug/ml的10ml溶液,在3000r/min离心20min,在离心力场作用下形成单一区带, 说明所含多糖较单一。 1 安磊. 蝉蜕的抗惊厥作用. 中国医药导报，2008，4(15) :35～36. 2 牛跃华，陈锡林. 中药蝉蜕传统应用和现代研究概况. 浙江临床医学，2000，2(4) :281～282. 3 冷丁. 蝉蜕的药用. 医药与保健，2001，12:16. 4 肖凤双，苏素文，王永梅. 蝉蜕治疗咳喘临床应用举隅. 河北中医药学报，2007，22(4) :17