如何检验rna纯度.docVIP

首先提出问题，大家先想想，最后我再给出我的答案。问题RNA样品1：260/280＝1.7，260/230＝0.5 RNA样品2：260/280＝2.06，260/230＝0.5这组比值说明哪个样品相对好些呢？why？ 下图是tris对吸收谱的影响，结果表明tris对RNA样品的吸收谱没有影响。  下图是异丙醇对吸收谱的影响，结果表明异丙醇对溶解于TE中的RNA样品的吸收谱没有明显影响。  下图是乙醇对吸收谱的影响，结果表明乙醇对溶解于TE中的RNA样品的吸收谱没有明显影响。  下图是蛋白对吸收谱的影响，结果表明蛋白对RNA样品的吸收谱有明显影响。当0.5％BSA蛋白质污染时，蛋白污染会导致260和280的数值都下降，其净结果是260/280比值下降，但260/280的比值变化并不显著，正如分子克隆3所说。但蛋白残留会导致230的数值显著上升，显著影响260/230的比值。也就是说，如果RNA样品的260/280＝1.7，260/230＝0.5，那么就应该考虑污染原因不是胍盐残留，而是蛋白残留（如图所示）  酚的最大吸收峰在270。酚的残留会显著的增加230、260和280的数值，同时酚的吸收峰与核酸的吸收峰合并后，最大吸收峰向270方向偏移，也就是说最大吸收峰在270附近。也就是说，如果RNA样品的260/280=1~1.5，260/230=1~1.5，那么污染原因就应该考虑是酚残留。当然酚的残留不能简单的用两个比值来确定，比如中间的图中当酚残留0.1％时，260/280＝1.72，260/230＝1.8，这是一组较好的数据，但进行220～320nm的光谱扫描后发现，最大吸收峰在270nm，所以有酚残留。  与酚不一样，胍盐残留不会影响260和280的数值，对260/280的比值不会造成大的影响，当然也不影响RNA定量。但胍盐残留对260/230比值具有明显影响。例如本例中260/230的比值小于0.21时，260/280的比值还2。也就是说，如果RNA样品的260/280=2，260/2301，那么污染原因就应该考虑是胍盐残留。  胍盐对RNA样品吸收有显著影响，会在小于230nm处产生大的吸收峰。  上面的图片和数据都是针对单一污染进行的分析，但不能不说我们遇到的污染往往是多种污染物的不同量的组合，因此在实际实验时，要根据自己的裂解液种类、漂洗方式、OD值、吸收峰等多种数据来判别，而且这??一个长期的经验积累过程，练习多了也就容易了。当然判别RNA样品的好坏还有一个很简单也很好的方法，如果不影响后续实验，这种RNA样品都是合格的（不管OD值如何）。 纯的RNA，230：260：280＝1：2：1 用分光光度计测量RNA时，用水而不是用TE 缓冲液稀释RNA样品会造成A260/A280比值下降。原因是低离子强度和低pH溶液会增加280 nm处的光吸收值。