第九章 基因功能研究常用方法技巧.ppt

; 弄清基因的生物学功能,才能明确基因在疾病发生中的具体作用、弄清疾病发生的分子机制。常用的基因功能研究技术包括： （1）DNA克隆技术 （2）转基因技术和核转移技术（动物克隆） （3）基因敲除技术 （4）反义技术 （5）RNA干涉技术 ;; ;技术水平：分子克隆 即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）　;DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。 也称基因克隆或重组DNA 。 ;生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等;（二）工具酶;（三）目的基因;（四）基因载体;克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。;载体的选择标准;1. 质粒 (plasmid);λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）;3. 粘性质粒(cosmid);酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）;二、重组DNA技术基本原理; 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程;（一）目的基因的获取;（二）克隆载体的选择和构建;（三）外源基因与载体的连接;受体菌条件 安全宿主菌（从大肠杆菌K-12改造） 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态;（五）重组体的筛选 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等;重组DNA技术操作的主要步骤;;转基因技术 采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。 ; 转基因生物是指用实验方法导入的外源基因??染色体基因组内稳定整和并能遗传给后代的一类动物。自从1982年Palmiter等首次将大鼠生长激素基因导人小鼠受精卵雄性原核中，获得了个体比对照组大一倍的转基因“超级小鼠”以来，这项高新技术受到各国重视，发展迅速，取得不少突破，全世界已申请的工程动物专利达到80多项。;转基因动物是动物整体水平研究目的基因的生物技术，特点是“分子及其细胞水平的操作，组织及动物整体水平表达”; 转基因动物构建过程; 转基因的技术方法; 转基因动物的鉴定; 转基因技术的应用;;核转移技术 即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆(clone)。 这样的个体所携带的性状仅来自一个父亲或母亲个体,为无性繁殖. 1996年,克隆羊”多莉”的产生成为当年分子生物学发展最重要的事件; ;;基因剔除技术 也称基因靶向(gene targeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。; 基因剔除程序; 基因转移和基因剔除技术在医学中的应用;;基因沉默技术;反义技术;RNA干涉(RNAi);RNAi技术;;;;RNAi技术; 《医学分子生物学》课程作业 根据自身专业和研究方向，以 《RNAi技术在XXX领域的研究进展》为题目，写一篇小综述。 写作要求： 1. 按照一般发表文献的格式书写。 2. 可查阅CNKI（中国知网）或Pubmed上相关文献，不得抄袭！ 3. 字数：3000字左右。 4. 不得抄袭！;论文格式;;疾病相关基因的克隆与鉴定Cloning and Identification of Disease Relative Genes;克隆疾病相关基因的策略;定义 从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。;克隆方式 ① 利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库； ② 根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选cDNA文库。;（二）定位克隆;基因定位的基本方法;体细胞杂交:;原位杂交和荧光原位杂交(FISH):;连锁分析; 定位克隆