第二章第三节 基因工程基本技术讲解原理.ppt

脉冲场凝胶电泳可分离相对分子量大的DNA片段。 2、检测技术----核酸纯度、浓度与相对分子量的测定 （1）紫外分光光度法 A.含量测定 ds-DNA：1 OD260≈50μg/ml ss-DNARNA：1 OD260≈40μg/ml 单链寡核苷酸：1 OD260≈33μg/ml 双链DNA含量=OD260×50×稀释倍数（μg/mL） RNA含量=OD260×40×稀释倍数（μg/mL） 单链DNA含量=OD260×33×稀释倍数（μg/mL） B.纯度估测 DNA：OD260/OD280=1.8 若＞1.8，说明RNA未除尽 ＜1.6，蛋白质或酚未除尽 RNA：OD260/OD280=2.0 ＜2.0，蛋白质或酚未除尽 OD260/OD230 ＞ 1.0，这表明样品几乎无多糖和酚 类污染 完整度判断： 三条RNA带都没被降解，说明可以继续往下做。 （2）琼脂糖电泳法 A.EB亮度判断含量－－标准是Makers B.电泳迁移速率与相对分子量的对数成反比 C. 由电泳带清晰度判断是否有污染 （三） 分子杂交 P48-51 检测目的片段（DNA、RNA、蛋白质）的存在。 DNA与DNA杂交 RNA与RNA杂交 抗原与抗体反应 DNA RNA 蛋白质 电泳也是检测目的片段的存在，那杂交 与电泳的区别？ 人工合成、酶切、PCR、文库、cRNA 重组产物 目的基因 克隆载体 连接 重组DNA分子 细菌中原核表达 在植物中表达（转基因植物） 在酵母中表达 病毒中表达 分离纯化 上游技术 下游技术 酶切 酶切 转化感受态宿主细胞 目的基因被克隆增殖 构建其表达载体 转化感受态宿主细胞 PCR和酶切鉴定 Southern Northern Western 筛选检测鉴定 核酸电泳是检测在体外扩增的目的片段---DNA、RNA、质粒等。 蛋白质电泳是检测组织细胞中积累的蛋白质。 特点是：灵敏度差，只能在一定量的核酸或蛋白质的情况下才能检测出。 如果目的片段是微量的---- 细胞中目的基因是否转入？ 目的基因通过表达载体是否转录？ 目的基因是否翻译？ 带重组子的克隆载体在宿主细胞中的检测----PCR、酶切 带重组子的表达载体在宿主细胞中的检测----杂交 1、、分子杂交的概念与原理 （1）、探针（Probe） :抗体或经放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记的已知序列的核酸片段。 探针可用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。 探针的来源： 目的基因的部分已克隆序列 与目的基因同源性很高的已克隆的其它基因 寡核苷酸探针 （2）、什么是分子杂交? Molecular hydridization 杂交（遗传育种中）概念： 分子杂交(生物化学中)概念: 具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。 分子杂交(分子克隆中)概念: 探针与样品结合以检测样品中是否存在与探针具有同源性的核酸分子或与特异性的蛋白质存在的过程. 样品 ↓转移到 尼龙膜 ↓←探针制备 杂交 ↓ 放射自显影或显色观察 基本程序： （3）、分子杂交的原理: A.碱基互补原则（DNA、RNA）：根据两条核酸单链中互补碱基序列能专一配对的原理，利用已标记的某核酸片段为探针，可以检测重组DNA分子中是否有与探针同源的序列。 B.抗原抗体反应（蛋白质）：抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应.  分子杂交种类 (1). 按样品分子种类划分 1） DNA杂交（样品为DNA）—探针为DNA或RNA 2） RNA杂交（样品为RNA）—探针为DNA或cDNA 3） 蛋白质免疫分析（样品为蛋白质---抗原）—探针为抗体 (2)、按照样品制备分类情况： 需检测样品（DNA或RNA或蛋白质）P48 DNA样品 southern 杂交 RNA样品northern 杂交 蛋白质样品western 杂交 转移杂交或印迹杂交 原位杂交 斑点杂交 原位裂解细胞得到样品 ↓←探针制备 杂交