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第五章 DNA体外重组技术讲解-唐旭东-2013级-jian.ppt

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第五章 DNA体外重组技术讲解-唐旭东-2013级-jian.ppt

第五章;概述;DNA克隆(DNA cloning); ※ “克隆”某一基因或DNA片段过程中,将外源DNA插入载体分子所形成的复制子是杂合分子-嵌合DNA,所以DNA克隆又称重组DNA (recombinant DNA)。;二、DNA重组技术基本程序;第一节; 作为基因工程载体所需具备的基本条件:;(一)按功能分类;1. 质粒的特征;克隆用质粒载体应具备的特点:;抗药基因或营养代谢基因;*lac Z N端146 aa残基编码基因 *lac Z编码产物为β半乳糖苷酶α片段(N端),突变型lac –E. coli可表达该酶的ω片段(C端),两片段单独存在无活性 *两端同时存在时有活性蓝色化合物 α互补( α complementation) *在Lac Z 基因内无外源DNA的插入,在含X-gal的培养基上生长时会出现蓝色菌落阴性克隆。 *在Lac Z 基因内插入外源DNA,在含X-gal的培养基上生长时会出现白色菌落阳性克隆。; ;α互补筛选法-(2’37’’);Ampr;Ampr;pUC18/pUC19;pMD-18 T simple克隆载体的结构 ;2. 质粒载体的分类:;pET-32a(+)原核表达载体的结构 ;pcDNA3:真核细胞表达质粒;(二) ?噬菌体; ?噬菌体作为载体具有两个特点;(三)粘粒载体(cosmid);(四) 酵母人工染色体载体(YAC);;一、限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease,RE) ;Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(基因工程技术中常用Ⅱ型) 切——基因工程的手术刀;Ⅱ类酶识别序列特点 识别顺序一般为4~6个碱基,通常为回文结构(palindrome) (核苷酸序列呈二元旋转对称,180°反向重复);Bam HⅠ; ; ;酶单位定义:;二、DNA聚合酶;二、DNA聚合酶;323个氨基酸;二、DNA聚合酶;3′?5′外切酶活性的功能;;反转录病毒细胞内的逆转录过程;三、DNA连接酶(DNA ligase) ——基因工程的缝纫针;四、其他修饰酶;催化DNA、RNA以及核糖和脱氧核糖三磷酸上的 5′ 磷酸基团水解。;;一、采用限制性内切酶酶切法直接分离目的基因;三、基因组文库或cDNA文库的构建和筛选;组织或细胞染色体DNA; cDNA文库(cDNA library,C文库): 将细胞内所有mRNA 逆转录为cDNA,再将所有cDNA片段克隆到适当的载体中 ,并将其导入适当的宿主细胞,宿主细胞中含有不同cDNA片段的克隆载体混合物就是C文库。;mRNA ;*由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。; 本方法适用于氨基酸残基数目较少的蛋白??因。;第四节;一、PCR产物的克隆策略;(二)T/A克隆法;TA克隆方法(一步PCR克隆);(一)粘性末端连接法;Bam HⅠ切割反应;(二)平头末端连接法;(三)人工接头法;(四)同聚物接尾法;第五节;一、重组DNA分子导入受体细胞转;重组DNA分子导入方式: 转化(transformation) 将重组DNA分子导入原核细胞的过程。 转染(transfection)   将重组DNA分子导入真核细胞的过程。 感染(infection)   以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建的重组DNA,经体外包装成具有感染性的噬菌体或病毒颗粒后,借助噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA注入原核或真核细胞,使目的基因得以繁殖的过程。;转化(transformation);基因导入装置 (Bio-Rad) ;     转染(transfection)   分类:瞬时转染 稳定转染:G418(Geneticin);非转化子;Ampr;BamH I;(插入失活法) 抗药性标记选择;;插入失活筛选法(1’20’’);(三)酶切电泳鉴定; α互补;重组CK2β 亚基转化子的筛选 第1,2,3,5,7,9,10,11,12,13号克隆是阳性克隆; 第4,6,8号是阴性克隆;1. λDNA/EcoR I+Hind Ⅲ 2. recombinant plasmid /Nde I+Hind III 3. recombinant plasmid /Hind III 4. pT7-7/ Hind III ;(四)序列分析;ABI PRISM 310型 DNA测序仪;(五)其他方法;覆盖 滤膜;菌落印迹杂交 (6’03’’);SDSpurified recombinant human CK2 β subunit and Western blot;重组DNA技术操作过程可

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