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实验二pcr技术及应用2012
8.jpg实验三 PCR技术及其应用 实验目的(Objective) 掌握PCR基本原理和方法 熟悉PCR技术的应用 PCR技术的诞生 Kary Mullis PCR技术发明人 7.jpgPCR技术基本原理 PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--7.jpg延伸三个基本反应步骤构成。 PC7.jpgR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ PCR反应体系 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 加双蒸水至总体积 一、PCR操作步骤(Methods) 在冰浴中，按照以下次序将各种成分加入一个薄壁离心管中，PCR总体系25μl。 2×PCR Mix buffer? 12.5μl 7.jpg引物1 (10pmol) 0.5μl 引物2 (10pmol)???????????? 0.5μl DNA模板(1ng/μl) ??? 1μl 加ddH2O至?25μl，混匀。视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。 设定反应程序，将上述混合液置PCR仪中进行扩增。扩增条件为：5.jpg 94℃预变性2 min 5.jpg94℃ 30s → 58℃ 30s → 72℃ 30s 循环25次 最后在72℃，保温10min 二、PCR技术的基本原理(Principles) 1.体外DNA分子的热变性和退火 2.体细胞分裂中DNA的半保留复制机理 3. dNTP存在时，耐热Taq DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA 5.jpg5.jpg三、PCR的基本过程 PCR 三步曲 ——PCR引物的设计 引物设计原则： 1.引物的特异性: 2.引物长度:一般为15～30bp 3.碱基分布：四种碱基最好应随机分布 4.3‘端要求：3端必须与模板严格互补 5.5‘端无严格限制：可以进行特异修饰（标记、设置酶切位点等） 引物设计软件： 四、基因工程操作过程 总结 ——PCR获取目的基因的方法: RT-PCR 五、结果观察(Observation of results) PCR结束反应，取10μl扩增产物，加1μl DNA 染色试剂Syber Green，电泳检测。 在波长为254nm的紫外灯下，观察染色后的电泳胶板。DNA存在处显示出绿色的荧光条带。 双酶切鉴定电泳结果 PCR产物电泳结果 六、思考题(Questions) PCR扩增与细胞内DNA半保留复制有何异同？ * 1 2 实验一 质粒提取及酶切鉴定 实验二 PCR技术及应用 CONTENTS 30s 30s 30s 25-30 cycles 变性 94?C 退火 58?C 延伸 72?C 1. 分离并获取载体和目的基因 2. 载体和目的基因的限制酶切 3. 载体和目的基因的重组连接 4. 重组DNA的转化和扩增 5. 重组DNA的筛选和鉴定 ? ? ? ? ? * *
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