cas9培训技术讲座.pptx

CRISPR/Cas9: 生物体和细胞基因组编辑的革命性技术 YSY Biotech 2014年4月10日;敲降 （knock down）;敲降 （RNAi）;基因敲除 (Gene Knockout) 基因敲除 :将生物体（或细胞）中的基因改变成无功能性基因（无效等位基因：null allele）的一种遗传学技术 【A gene knockout (KO) is a genetic technique in which one of an organism‘s genes is made inoperative. /wiki/Gene_knockout 】 ;定向的基因敲除 （Targeted Disruption of A Gene) 基因敲除突变体（广义上）的获得： 1、随机突变（如ENU饱和突变等） 需要通过位置克隆（positional cloning）确定突变基因；费时费力。 2、定向的基因敲除 精确 传统上定向的基因敲除是通过基因打靶（gene targeting）技术实现的;基因打靶(Gene Targeting) 基因打靶是利用同源重组原理改变细胞或生物体内源性基因的遗传学技术 【Gene targeting is a genetic technique that uses homologous recombination to change an endogenous gene. /wiki/Gene_targeting】 特点（基因修饰精确、遗传背景清晰干净）： 1、删除基因 2、去除外显子 3、定点插入一个基因（Knock in） 4、引入点突变 5、就制作删除基因或外显子而言，可实现永久性(conventional, 全身性)或条件性（conditional, 组织或时空）特异性的基因敲除;起始，以酵母为模式生物，建立了一套外源基因插入、修饰、标记、同源重组转化子筛选系统的建立、载体同源序列DNA（靶标）双链断裂提高同源重组效率的利用 ;/wiki/File:GeneTargeting.png;Mario Renato Capecchi ;依赖于胚胎干细胞的传统的基因打靶;传统的基因打靶（Gene Targeting）的技术瓶颈 1、需要胚胎干细胞 只有小鼠上能建立胚胎干细胞 大鼠的胚胎干细胞虽有报道，但没有后续的工作 2、极低的同源重组率 干细胞同源重组发生率较高，但也只有百万分之一 ;通过将基因敲除的个体或细胞与正常的个体或细胞相比较，研究者可以揭示特定基因的功能。 基因敲除技术特点：在基因组水平上将目标基因修改成无效等位基因，遗传背景干净清晰，是研究基因功能的金标准。 敲降（RNAi 或MO KD）的缺点： 1、仅部分抑制该基因的功能； 2、在转录后（包括翻译）水平上下调基因表达，不能遗传 3、非特异性强；脱靶效率高;如何突破基于传统的基因打靶（Gene Targeting）实现基因敲除（Gene Knockout）的技术瓶颈？ 向细胞学习！;DNA Damage and DNA repair DNA damage, due to environmental factors and normal metabolic processes inside the cell, occurs at a rate of 1,000 to 1,000,000 molecular lesions per cell per day ;Double-strand Breaks and Repair Double-strand breaks (DSBs), in which both strands in the double helix are severed, are particularly hazardous to the cell because they can lead to genome rearrangements. Three mechanisms exist to repair DSBs: 1) non-homologous end joining (NHEJ) 2) microhomology-mediated end joining (MMEJ), 3) homologous recombination (HR);;Non-homologous end joining (NHEJ) NHEJ (coined in 1996 by Moore and Haber) is referred to as non-homologous because the break ends are directly ligated w