生物化学实验（复旦大学）血清蛋白电泳－徐洁杰.pptVIP

实验三 血清蛋白电泳 基础医学院生化系 徐洁杰 电泳：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动。 电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。 电泳基本原理： COO- COO- COOH ╱ + H+ ╱ + H+ ╱ Pr ←————→ Pr ←————→ Pr ╲ + OH- ╲ + OH- ╲ NH2 NH3+ NH3+ PHPI PH=PI PHPI 蛋白质N端游离氨基，C端游离羧基以及侧链上一些基团在一定pH条件带电荷， 因此可以用电泳技术分离和鉴定。 电场力 F=XQ （X：电场强度， Q：电荷量） 阻力 f=6π γ ηv （γ：半径，η：介质粘度） 当电泳颗粒匀速运动: F= f QX=6πγην ν=QX/6πηγ 带电粒子的迁移率 ν/X 用μ表示，称迁移率（mobility）,即带电颗粒在单位电场强度下的移动速度。 迁移率，取决于带电粒子的电荷量Q 、粒子大小γ和形状。 Q越多，V越大；γ越小，V越大；球形分子纤维状。 μ=ν/X=Q/6πηγ 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE polyacrylamide gelelectrophoresis） 实验装置 安装步骤 把垂直平板电泳槽和两块玻璃板洗净、晾干 将两块玻璃板置于夹子内，调整至两块玻璃板左右两侧和底边对齐后，锁定夹子 将带有玻璃板的夹子卡在配胶架上 加双蒸水检验是否漏水 凝胶制备 试剂 分离胶（ml） 浓缩胶（ml） 分离胶缓冲液 1.25 － 单体交联剂 2.5 1.5 浓缩胶缓冲液 － 1.24 蒸馏水 6.15 7.16 催化剂(AP) 0.1 0.1 SDS 0.1 0.1 TEMED* 0.008 0.004 总体积 10 10 丙烯酰胺浓度 7.5 4.5 TEMED临用前加入；有毒，避免接触皮肤 分离胶制备 倒掉玻璃板中的双蒸水 向分离胶中加入TEMED，混匀 用移液器吸取分离胶，沿壁加入垂直平板中，直至胶液的高度达平板高度的2/3左右 上面再覆盖一层双蒸水 室温下静置约20min即可聚合 单体丙烯酰胺（Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)交联而成，形成三维网状凝胶。 催化剂：过硫酸铵(AP) 加速剂：四甲基乙二胺（TEMED） 聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel, PAG）的聚合反应： 凝胶的机械性能 凝胶总浓度 T%=（a+b）/m 凝胶交联度 C%=b/(a+b) a：凝胶溶液中所含Acr g数 b：凝胶溶液中所含Bis g数 m：凝胶溶液中缓冲液体积的ml数 凝胶的孔径 T%越大，孔径越小。 蛋白质分子量范围（KDa） 适用的凝胶浓度（T%） 30~200 5 15~100 10 10~50 15 2~15 20 缓冲液离子成分、PH的不连续性： 电极缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液，样品及浓缩胶中为pH6.8 Tris-HCL缓冲液。 甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子。 浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子。 蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，蛋白质被压缩。 三大效应： 浓缩效应 成分 pH值 孔径 电泳缓冲液 甘氨酸(慢离子) 8.3 样品 蛋白质 6.8 浓缩胶 Cl-(快离子) 6.8 大 分离胶 Cl-(快离子) 8.8 小 凝胶孔径不连续性 缓冲体系不连续性 电位梯度不连续性 分子筛效应： 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。 当样品进入分离胶，凝胶孔径小，移动慢。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。 电荷效应： 电荷量不同，迁移率不同。 浓缩胶制备 将分离胶上层的双蒸水倒出 向浓缩离胶中加入TEMED，混匀 用移液器吸取浓缩胶加到分离胶的上面，加满 将梳板插入，注意梳齿边缘不能带入气泡 室温下静置约10min 即可聚合 加样 将平板放入电泳槽 加入电泳缓冲液（先内后外） 取出梳板 用移液器分别吸取蛋白样品15ul，进行加样 电泳 接通电源 浓缩胶电压80V，分离胶调节电压为150V 待溴酚蓝移至凝胶底部1～1.5cm时，切断电源 染色，观察结果： （1）将胶从玻璃板中取出，注意不要弄断凝胶。 （2）凝胶考马斯亮蓝染色，15-30min。 注意：考马斯亮蓝要回收。