实验五 层析技术 2014.10.22.ppt

层析法的定义和基本原理 问题 1）封闭液的用途是封闭固相载体膜上未吸附结合蛋白质的区域，避免一抗与膜发生非特异性结合，为什么一抗会与膜发生非特异性结合？ 2）课本上说Western blotting可以检测电泳分离的特异性目的蛋白的存在与否和含量，那么含量是如何检测出来的？ 3）转膜用的PVDF膜为什么要经甲醇脱色？ 4）GAPDH的分子量大小约为36kD，那为什么结果的照片中显示出了包括36kD左右在内的好几条信号带？? * * 实验五 层析技术孙启明2014-10-22 定义：层析法又称色谱法（Chromatography），是广泛应用的一种生物化学技术，层析法是利用混合物各组分物理化学性质（如溶解度、吸附能力、电荷和分子量等）的差别，使各组分在支持物上集中分布在不同区域；借此将各组分分离。 原理：层析利用两个相，一个相称为固定相；另一个相称为流动相。由于各组分受固定相的阻力和受流动相的推力影响不同，各组分移动速度各异，从而使各组得到分离。 层析法的分类 分类：层析法有多种类型，液体作为流动相的称为液相层析，气体作为流动相称为气相层析。 1．按两相所处的状态分类：色谱中有两相，即流动相和固定相。流动相可以是气体或液体，固定相可分为固体吸附剂和涂在固体担体或毛细管内壁上的液体固定相。 （1）气相色谱法：用气体作流动相的色谱法。再按固定相的状态，气相色谱又可分为气固色谱和气液色谱 （2）液相色谱法：用液体作流动相的色谱法。再按固定相的状态，液相色谱亦可分为液固色谱和液液色谱 2．按固定相的使用形式分类：可分为柱层析、纸层析和薄层层析。纸层析和薄层层析属于平面层析。 （1）柱层析：固定相装在玻璃管或金属管内，或涂在柱内壁上。又分为填充柱色谱和空心毛细管色谱。层析时在柱顶部加入要分离的样品溶液，假如样品内含两种成分A与B，样品溶液全部流入吸附柱之后，加入合适的溶剂洗脱，A与B也就随着溶剂向下流动而移动，最后达到分离。连续分段收集洗脱液，各成分即可顺序洗出。 （2）纸层析：用滤纸作载体，吸附在滤纸上的水为固定相, 溶剂为液相，试样溶液在纸上进行展开、分离。 （3）薄层层析：将固定相(吸附剂粉末)均匀地涂铺在玻璃板上或塑料板上，样品的展开、分离在其上进行。薄层层析法是将吸附剂在玻璃板上或其它薄膜上均匀地铺成薄层，把要分析的样品加到薄层上，然后用合适的溶剂展开，而达到分离鉴定的目的。优点是设备简单，操作容易，层析展开时间短，分离效率高，并可采用腐蚀性显色剂，而且可以在高温下显色。 3．按层析过程的机理不同，层析法可以分为下列几种类型： ①吸附层析 ②分配层析 ③离子交换层析 ④凝胶层析 ⑤亲和层析。 实验内容 （1）纸层析－转氨基作用的验证 （2）薄层层析－脂类的分离 （3）离子交换层析－混合氨基酸分离凝胶层析 （4）血红蛋白和DNP－鱼精蛋白分离（不要求） 纸层析法－转氨基作用验证 【基本原理】 体内α-氨基酸的α-氨基在氨基转移酶的作用下，移换至α-酮酸的过程，称氨基移换作用。此类酶各有一定的特异性，普遍存在于动物各组织中。 本实验是将谷氨酸与丙酮酸在肝匀浆中的谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶(简称谷-丙转氨酶)的作用下进行氨基移换反应，然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。其反应过程如下： 转氨基作用 由于谷氨酸、丙酮酸在肝匀浆中可循其他代谢途径分解和转化，影响氨基移换过程的观察，因此在反应体系中添加一碘醋酸(或一溴醋酸)以抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代谢过程。 【纸层析法－转氨基作用验证操作步骤】  一、肝匀浆的制备 取小白鼠1只，颈椎脱臼法处死后，取出肝脏，经0.9% NaCl溶液洗去血污后，称取肝脏约1 g，置研钵中加入玻璃砂少许(或用玻璃匀浆器研磨)，然后加0.01 mol/L，pH=7.4磷酸缓冲溶液1ml磨成匀浆，之后再加入4ml磷酸缓冲液。 二、转氨酶反应 1．取短玻璃管2只编号(1、2)，各加肝匀浆10滴，先将2号管置沸水浴中5分钟（酶灭活对照管）。 2．两管各加1%谷氨酸钾溶液10滴，1%丙酮酸钠溶液10滴，0.25%一碘醋酸钾溶液5滴，同置40℃水浴中保温30分钟。 3．取出，向两管各加5% HAc溶液2滴，再同置沸水浴中5分钟，冷却后各取0.5ml反应溶液离心(2000 r/min，5 min)，将上清液移入另外同样编号的塑料离心管中备用。 三、层析验证 1．在10 cm×20 cm滤纸上，距短边2.5 cm处用铅笔轻轻画一线(原线)，在原线上，每隔1.5cm处用铅笔作记号，并在线下底边注明1、2、谷氨酸、丙氨酸记号。 2．用毛细管分别吸取1号液、2号液在层析滤纸上点样，注意斑点不可太大，一般直径约0.3 cm为宜，约5 min等干后，在1、2号原点上，再