2甲磺酰基54氟苯基1 3 4噁二唑对水稻白叶枯病菌蛋白的亲和层析研究 word格式.docxVIP

目录摘要1Abstract2缩略词列表4前言5第一章文献综述61.1 亲和层析简介61.1.1 亲和层析原理61.1.2亲和层析基质71.1.3间隔臂71.1.4 亲和配体81.1.5基质的活化91.1.6亲和配体与基质偶联率的测定91.2 亲和层析的国内外研究现状91.3小结23第二章论文设计思想242.1 目的和意义242.2 设计思想242.3 合成路线252.3.1亲和配体衍生物中间体及目标化合物2-甲磺酰基-5-(4-氟-3-溴甲基苯基)-1,3,4-噁二唑的合成路线252.3.2 亲和层析介质的制备262.4拟解决的关键问题27第三章实验部分283.1实验仪器和试剂283.2 亲和配体衍生物中间体及目标化合物2-甲磺酰基-5-(4-氟-3-溴甲基苯基)-1,3,4-噁二唑的合成283.2.1 4-氟-3-甲基苯甲酸甲酯的合成283.2.2 4-氟-3-甲基苯甲酰肼的合成293.2.3 2-巯基-5-(4-氟-3-甲基苯基)-1,3,4-噁二唑的合成293.2.4 2-甲硫基-5-(4-氟-3-甲基苯基)-1,3,4-噁二唑的合成303.2.5 2-甲硫基-5-(4-氟-3-溴甲基苯基)-1,3,4-噁二唑的合成303.2.6 2-甲磺酰基-5-(4-氟-3-溴甲基苯基)-1,3,4-噁二唑的合成313.2.7 2-甲磺酰基-5-(4-氟-3-溴甲基苯基)-1,3,4-噁二唑及其中间体结构的表征313.2.8抗水稻白叶枯病菌活性的测试方法323.3亲和层析介质的制备333.3.1 琼脂糖凝胶CL6B的活化333.3.2 间隔臂与琼脂糖凝胶CL6B的偶联343.3.3 亲和配体与琼脂糖凝胶CL6B的偶联343.3.4 对照亲和层析介质的制备343.3.5 琼脂糖凝胶CL6B活化量和亲和配体在琼脂糖凝胶CL6B含量的表征353.4 水稻白叶枯病菌蛋白粗提液的制备及总蛋白浓度的测定363.4.1 水稻白叶枯病菌的培养363.4.2水稻白叶枯病菌蛋白粗提液的制备373.4.3 水稻白叶枯病菌蛋白粗提液中蛋白浓度的测定383.5 水稻白叶枯病菌的亲和层析研究403.5.1 亲和层析403.5.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS电泳）40第四章结果与讨论444.1 亲和配体衍生物2-甲磺酰基-5-(4-氟-3-溴甲基苯基)-1,3,4-噁二唑的波谱分析444.1.1 核磁共振氢谱444.1.2 核磁共振碳谱454.2生物活性测试结果464.3 琼脂糖凝胶CL6B的活化量以及亲和配体与琼脂糖凝胶CL6B的偶联率484.3.1琼脂糖凝胶CL6B的活化量484.3.2 亲和配体与琼脂糖凝胶CL6B的偶联率484.4 水稻白叶枯病菌总蛋白粗提液中的蛋白浓度494.5 SDS电泳分析50第五章结论515.1 研究结果515.2 创新点515.3 不足之处525.4 展望52致谢53参考文献54附录61附图62原创性声明66关于学位论文使用授权的声明66摘要本课题组在前期的工作中发现化合物2-甲磺酰基-5-(4-氟苯基)-1,3,4-噁二唑对水稻白叶枯病菌有良好的抑制活性，然而该化合物所作用的水稻白叶枯病菌靶标蛋白并不知晓。本课题拟采用亲和层析技术鉴定2-甲磺酰基-5-(4-氟苯基)-1,3,4-噁二唑作用的水稻白叶枯病菌所蛋白，希望为研究该类化合物与水稻白叶枯病菌的作用机制奠定一定的基础，进而为抑制该病菌的新型、高效、绿色的农药研究和开发提供一定的理论依据。本论文通过对亲和配体2-甲磺酰基-5-(4-氟苯基)-1,3,4-噁二唑进行结构修饰，合成了2-甲磺酰基-5-(4-氟-3-溴甲基苯基)-1,3,4-噁二唑化合物，生物活性测试结果表明，在200 μg/mL和100 μg/mL的浓度下该化合物对水稻白叶枯病菌的抑制率分别为100.0±2.4%和99.9±3.7%，与亲和配体化合物的抑制率相当（100.0±1.6%和100.0±1.5%），其EC50为11.53±1.47μg/mL，略高于亲和配体化合物的EC50（9.98±1.52 μg/mL），说明经修饰过后的化合物的生物活性没有明显下降，可以用于亲和层析介质的制备。将修饰后的化合物2-甲磺酰基-5-(4-氟-3-溴甲基苯基)-1,3,4-噁二唑与琼脂糖凝胶CL-6B共价结合制备成所需要的亲和层析介质，亲和配体的偶联率达到154 μmol/g(干胶)，满足亲和层析要求。将亲和介质与水稻白叶枯病菌蛋白的粗提液共同孵化，先将未结合的蛋白用洗涤液洗出，然后加入LoadingBuffer，在95oC 下加热洗脱与亲和层析介质结合的蛋白，然后进行凝胶电泳（SDS）分析，结果表明蛋白分子量大约在68 kDa、22kDa的蛋白可能为亲和配体2-甲磺