不同高糖模型大鼠脂肪、肝脏和骨骼肌自噬的变化研究-内科学(内分泌与代谢病)专业论文 word格式.docxVIP

附图1 电镜下的自噬小体（AP）和自噬溶酶体（AL）From:Autophagy:AForty-YearSearchforaMissingMembraneSource.PLoSBiol4(2):e36.附图2 自噬的三种途径From: Autophagy in the liver. Hepatology, 2008. 47(5): p. 1773-85附图3 自噬的形成A2550%葡萄糖血糖(mmol/L)200.45%NaCl15B胰岛素(ng/ml)15.510.550%葡萄糖0.45%NaCl105.5500244872输注时间（h）0注时间（h）附图472h内葡萄糖输注组和对照组血糖的变化FROM:张宏利,etal., 短期持续高糖输注诱导胰岛β细胞增殖的大鼠模型建立.放射免疫学杂志,2010.23(3):p.318-321.材料与方法一．实验材料1．主要试剂RIPA试剂、PMSF（上海申能博彩）、蛋白酶抑制剂（ProteaseInhibitorCocktail），酪氨酸酶抑制剂（PhosphataseInhibitorCocktail2）、丝/苏氨酸酶抑制剂（PhosphataseInhibitorCocktail1）和链脲霉素(streptozotocin)均购自SIGMA公司（St.Louis,MO,USA）；柠檬酸试剂购自上海试剂一厂；BCA?蛋白浓度检测试剂盒购自美国Pierce公司；Tris-Base、Glycine、Tween-20、十二烷基硫酸钠（SDS）等产品均购自上海捷倍思公司。过硫酸胺（APS）、TEMED、DEPC购自上海生工。NC（硝酸纤维素膜）购自英国whatman公司。PVDF膜购自MINIPORE。脱脂奶粉为上海光明奶业公司生产的光明脱脂奶粉。ECLPLUS购自美国GE公司。0.9%氯化钠注射液（上海华源长富药业有限公司）、肝素钠、注射用青霉素钠、动物实验用戊巴比妥钠及相应无菌注射器均由瑞金医院提供；PVP（PlasdoneK29/32）购于美国ISPTECHNOLOGIESINC公司；silasticlaboratorytubing硅胶管（508-003），白色酸性硅胶购于DowCorning公司；TRIZOL试剂购自GIBCO-BRL；SuperScriptIII逆转录酶和Oligo(dT)引物购自Invitrogen公司；实时定量PCR测定试剂盒(Sybr@premixExTaq)购自Takara2．抗体LC3抗体、ATG5抗体购自美国Sigma公司，ATG7抗体、Atg12抗体、Beclin1抗体、P38抗体、Erk抗体、磷酸化Erk抗体、FOX03a抗体、磷酸化FOX03a（ser318/321）抗体、P53抗体、磷酸S6（ser235/236）抗体、SQSTM1/P62抗体、AKT抗体、磷酸化AKT(Thr308)抗体、磷酸化AKT(Ser473)抗体、AMPKa 抗体以及磷酸AMPKa（Thr172）抗体均购自Cellsignal。偶联有辣根过氧化物酶的GAPDH抗体购自上海康成生物。β-Actin抗体来自Abmart。IRDyeTM800CW染料标记的二抗为美国LI-COR公司。抗体稀释液为odyssey专用封阻液，购自美国LI-COR公司。3主要仪器设备1)台式冷冻离心机：德国Eppendorf公司2)电子分析天平：德国Heraeus公司3)ONE-TOUCH血糖仪：强生（中国）医疗器械有限公司4)水浴锅：德国GS公司。过滤器：美国millipore公司电子移液器：德国Eppendorf公司7)Odyssey 近红外双色激光成像仪：美国LI-COR公司8)清醒状态下大鼠持续给药专用笼：自行设计，中科院制造9)BiosenC_line葡萄糖/乳酸分析仪(EKF,Diagnostic) 10)微量注射泵（BRAUN）小型低温离心机（Eppendorf5415D）LightCycle480实时定量PCR仪（Roche）13)全波长紫外/可见光扫描分光光度计（ND-1000Spectrophotometer）4主要试剂的配制1)10×PBS缓冲液（应用液：1×PBS）NaCl80g，KCl2g，Na2HPO4.12H2O34g，KH2PO42g，ddH2O，37°C溶解，定容至1000ml。2)10×电泳BufferTris-base30.3克Glycine144克加去离子水，定容至1000mlSDS10 克3)10×转膜缓冲液称取30.3克Tris.base，144克Glycine，用ddH2O溶解，定容至800ml，临用前稀释为1×，加200ml甲醇4)分离胶缓冲液1.5MTris.HClPH 8.8称取18.15克Tris，加60mlddH2O溶解，