编码ck2激酶底物的c1orf109基因结构与功能研究-生物医学工程专业论文 word格式.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 Classified Index: Q71 U.D.C.: 577.21 Dissertation for the Doctor Degree in Engineering STRUCTURAL AND FUNCTIONAL STUDIES OF C1ORF109 GENE ENCODING THE SUBSTRATE OF PROTEIN KINASE CK2 Candidate: Liu ShanShan Supervisor: Prof. Li Yu Academic Degree Applied for: Doctor of Engineering Specialty: Biomedical Engineering Affiliation: Life Science and Engineering Date of Defence: April, 2012 Degree-Conferring-Institution: Harbin Institute of Technology 摘 摘 要 哈尔滨工业大学工学博士学位论文 哈尔滨工业大学工学博士学位论文 摘 要 癌症是导致人类疾病死亡的主要原因之一。侵袭和转移是恶性肿瘤细胞的 基本生物学特征，也是导致癌症患者死亡的主要原因。关于肿瘤细胞的侵袭和 转移的研究一直是生命科学的研究热点，但长期以来其分子机制一直未得到完 全阐明。 为了寻找参与肿瘤发生、发展及转移的相关基因，本课题组对细胞来源相 同但转移能力不同的两个人肺腺癌细胞系的基因表达差异进行分析时，获得了 一个存在差异表达的 cDNA 片段。随后，采用生物信息学方法、RACE (Rapid Amplification of cDNA End) 技术和 DNA 测序相结合的方法获得了该基因的 mRNA 全序列。BLASTN 比对结果显示，该基因与 Homo Sapiens Chromosome 1 ORF109 (c1orf109，序列号为 NM_017850.1) 同源，是一个功能未知的新基因。 为了进一步研究 c1orf109 基因的表达及生物学功能，在本文中将对该基因的转 录调控、亚细胞定位、表达模式、及其在细胞增殖和细胞周期调控过程中的作 用进行初步的研究。此外，还对其潜在的相互作用分子进行了筛选和验证。 本研究采用双荧光素酶活性分析、凝胶电泳迁移率分析（EMSA）和染色质 免疫沉淀（ChIP）分析等技术，对 c1orf109 基因启动子区的顺式作用元件和反 式作用因子进行了确认。结果发现，在 c1orf109 基因的启动子区域内存在两个 关键的顺式调控元件，CAAT box 和 TATA box。同时，实验结果还表明，c1orf109 基因的 5′非翻译区可以特异地结合转录因子 Sp1，转录因子 Sp1 参与 c1orf109 基因的转录调控过程。 为分析 c1orf109 基因产物的生物学功能，本研究首先对蛋白 C1ORF109 的 基本理化性质、亲疏水性、高级结构、功能结构域和磷酸化位点进行了生物信 息学预测，提示 C1ORF109 可能是蛋白激酶 CK2 的底物，其第 104、134、182 位丝氨酸残基是其潜在的磷酸化位点。在 C1ORF109 蛋白定位分析中，通过免 疫荧光和细胞组分分离等实验证实，C1ORF109 主要定位于细胞核和细胞质。实 验结果亦证实了 C1ORF109 是一个磷酸化蛋白质，并可在体外被 CK2 激酶特异 的磷酸化，CK2 激酶对 C1ORF109 的磷酸化不影响后者在细胞内的定位。 为明确 c1orf109 基因与肿瘤的关系，本研究还采用免疫印迹和实时定量 PCR 等方法对肝癌临床病例组织、乳腺癌细胞系、肺癌细胞系、黑色素瘤细胞 系中 c1orf109 基因的表达情况进行了分析。结果显示，肝癌组织 c1orf109 基因 mRNA 表达增高，蛋白表达与 mRNA 表达一致。而且 C1ORF109 蛋白在多种肿 - I - - - PAGE 2 - - - III - 瘤细胞系中均呈现表达增高的趋势。结合 C1ORF109 在肿瘤中表达上调的特点 和 CK2 激酶在细胞增殖调控中的作用，我们进一步分析了 c1orf109 基因在细胞 增殖、细胞周期调控和肿瘤细胞转移过程中的作用。pcDNA3.1-c1orf109 重组体 稳定转染乳腺癌 Hs 578T 细胞，在集落形成实验中，过表达外源 C1ORF109 重 组蛋白的细胞所形成的集落数明显增多（P0.05），PCNA（增殖细胞核抗原） 和 cyclin D1 的表达水平呈上升趋势，流式分析结果显示，过表达外源 C1ORF109 重组蛋白的细胞 G0/G1 期细胞所占比例明显减少，侵袭小