flavobacteriaceae sp.cz1127产岩藻聚糖硫酸酯酶的分离纯化 性质分析及应用 word格式.docxVIP

Flavobacteriaceae sp. CZ1127 产岩藻聚糖硫酸酯酶的分离纯化、性质研究及应用 摘要岩藻聚糖硫酸酯是海参体壁的重要组成成分之一，具有多种生理活性。多糖 降解后一方面有利于其结构解析，另一方面有可能提高其原有活性，而酶解法是 目前实现多糖 降解最为 理想的途 径。 实验 室前期自主筛 选出一株 海洋细菌 Flavobacteriaceae sp. CZ1127，其胞内能产生岩藻聚糖硫酸酯酶，可以降解多种 海参的岩藻聚糖硫酸酯。本研究在此基础上，进一步对CZ1127产岩藻聚糖硫酸 酯酶进行了分离纯化，并对其酶学性质及应用进行了研究。首先建立了基于pHBH法的岩藻聚糖硫酸酯酶酶活定量方法：准确移取375 μL 0.055%岩藻聚糖硫酸酯溶液(以pH 7.0 20mmol/L Tris-HCl 缓冲液溶解，内含 0.3mol/L NaCl)，加入375μL 酶液，混匀后于28℃酶解反应30min，随后加入pHBH 试剂250 μL，100℃反应5 min，迅速冷却后于415 nm处测定吸光值，根据单位时 间内还原糖的产生量计算酶活。该方法酶活检测限达0.048mU，约为DNS法1/20， 且方法灵敏度高、精密度高，可以满足微量测定的需求。通过 Cellufine Sulfate 亲和色谱、Mono Q 5/50 GL 阴离子交换色谱及 Superdex 75 10/300 GL 凝胶过滤色谱等色谱技术的联用实现了对 Flavobacteriaceae sp.CZ1127 胞内酶液中岩藻聚糖硫酸酯酶的纯化，并对其纯度进行了鉴定。纯化 得到电泳纯岩藻聚糖硫酸酯酶，酶活回收率为 1.8%，纯化倍数为 1476.5， SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳测得其分子量为 46kDa。对 CZ1127 产岩藻聚糖硫酸酯酶的 酶学性质研究表明：该酶最适反应温度为 35℃，酶液在 4℃下稳定性较好；最适 反应 pH 为 6.5，在 pH 6.5-9.0 的范围内酶活较为稳定；酶活的启动需要 NaCl 的 存在，且 NaCl 浓度为 0.15 mol/L 时酶活最高；Cd2+、 Hg2+ 、Zn2+对酶活有很 强的抑制作用，而 Ca2+对酶活有明显的促进作用。利用 Cellufine Sulfate 亲和色谱及 Mono Q 5/50 GL 阴离子交换色谱对 Flavobacteriaceae sp.CZ1127 胞内酶中硫酸酯酶进行了初步的纯化。对其酶学性 质研究表明：该酶最适反应温度 25℃，酶液在 4℃下稳定性相对较好，但失活速 度仍较快，24h 时酶活剩余量为 69.6%；最适反应 pH 为 8.5；在 pH 7-8.5 的范围 内酶活较稳定，pH 为 6 时酶活剩余不足 10%；酶活的启动不需要 NaCl 的存在，但添加适量 NaCl 有利于提高酶活，且当 NaCl 浓度为 0.3 mol/L 时酶活最高。通过调节酶液 pH 至 6.0 并在 4℃下贮存 48 小时，硫酸酯酶活力仅残余 9.7%，而岩 藻聚糖硫酸酯酶酶活剩余 80.3%，能够简单有效的实现硫酸酯酶的特异性消除。 通过研究酶解反应过程中加酶量、酶解时间与酶解产物分子量的关系，构建 了预测海参(海地瓜)中岩藻聚糖硫酸酯酶解产物分子量的反向传播-人工神经网 络模型，实现 了对海地 瓜岩藻聚 糖硫酸酯 酶解过程的预 测与控制 。构建的 BP-ANNS 为单隐层人工神经网络，网络输入值为加酶量和酶解时间，网络输出 值为酶解产物分子量，隐层神经元 7 个，隐层传递函数为 logsig，输出层传递函 数为 purelin，训练函数为 trainglm。其收敛步长为 74，MSE 为 0.00943，预测数据和真实值的误差平均为 1.06%，能够准确预测降解产物的分子量。 综上所述，本文建立了岩藻聚糖硫酸酯酶酶活定量方法，获得了 CZ1127 产岩藻聚糖硫酸酯酶的纯化产物并对其酶学性质进行了研究，建立了海参岩藻聚糖 硫酸酯的酶解模型，为 CZ1127 产岩藻聚糖硫酸酯酶及海参岩藻聚糖硫酸酯降解 产物的利用奠定了基础。 关键词：海参；岩藻聚糖硫酸酯；岩藻聚糖硫酸酯酶；硫酸酯酶；人工神经网络Study of purification, characteristic and application of fucoidanase from Flavobacteriaceae sp. CZ1127 AbstractFucoidan is an important component of sea cucumber body wall, and it possesses a series of biological activities which are closely related