flg22及其衍生多肽诱导的海带saccharina japonica雌配子体防御反应研究 word格式.docxVIP

Flg22 及其衍生多肽诱导的海带(Saccharina japonica)雌配子体防御反应研究 摘要我国是世界上海带产量和规模最大的国家，海带的年产量占世界海带产量的 60%。在海带的人工育苗和养殖过程中，时常爆发病害，严重的时候，病害可导 致海带减产 25-30 %，造成巨大的经济损失。因此，研究海带育苗及人工养殖期 病害发生的致病菌以及海带自身的抗病防御反应机制，对于海带病害的早期预 防、诊断以及制定合理的生产管理措施以降低病害发生的概率是非常必要的、也 是亟待解决的科学问题。现已证实 flg22 及其衍生多肽可诱导番茄（Lycopersicon esculentum）和拟南 芥（Arabidopsis thaliana）产生防御反应，具有激发子活性。而我们前期研究的 结果表明：flg22 也是海带（Saccharina japonica）的有效激发子。那么，flg22 的衍生多肽是否也可诱导海带产生免疫防御反应？针对这个问题，本文运用鲁米 诺 荧 光 检 测 法 和 荧 光 探 针 2’,7’- 二 氢 二 氯 荧 光 黄 双 乙 酸 钠（2,7-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）染色的方法，研究了人工合成的 flg22 及其衍生多肽诱导的海带雌配子体防御反应，以期建立稳定的激发子-海带 实验模型，并为海带识别病原体或激发子的识别受体及其诱导的信号转导途径研 究奠定前期工作基础。研究结果不仅可丰富海带分子病理学理论，也可为抗病海 带新品系的繁育提供理论依据。研究结果如下：1、Flg22 及其衍生多肽诱导的海带雌配子体 H2O2 的定量检测 运用鲁米诺荧光检测法，研究了不同浓度 flg22 及其衍生多肽—flg15、flg14及 flg22D43A 诱导的海带雌配子体 H2O2 的产生。在 0-200 μM 的浓度范围内，flg22 和 flg15 诱导海带雌配子体产生的 H2O2 随着多肽浓度的增加而增加，当浓度增 加到 260 μM 时，雌配子体释放的 H2O2 没有明显上升。此外，诱导海带雌配子 体产生相同的 H2O2 释放量，所需 flg22 的浓度略低于 flg15 浓度，说明 flg22 作 为激发子，其活性强于 flg15。对于 flg14，400-1000 μM 范围内，海带雌配子体 产生 H2O2 的量随着浓度的增大而增大。Flg22D43A 是将鞭毛蛋白 N 端第 43 位的天冬氨酸突变为丙氨酸的突变多肽。I在高等植物中，第 43 位的天冬氨酸是 flg22 具激发子活性的活性位点。研究结果表明，1000 μM 的 flg22D43A 仍不能诱导海带雌配子体产生 H2O2，说明鞭毛 蛋白 N 端第 43 位的天冬氨酸也是 flg22 作为海带激发子的活性位点。相同浓度下 flg22、flg15、flg14 及 flg22D43A 不同诱导时间的实验结果表明： 当浓度为 90 μM 时，在 0-2 h 内 flg22 和 flg15 诱导海带雌配子体释放的 H2O2 随 着时间的延长而增加，并在 2 h 达到峰值，分别为 2400 RLU 和 1865 RLU（relative light unit）。随后 H2O2 释放量随着诱导时间的延长而减小，6 h 后 H2O2 释放量恢 复到初始水平。其中在相同诱导时间下，flg22 诱导雌配子体产生的 H2O2 略高于 flg15。而 flg14 和 flg22D43A 诱导的 H2O2 在 6 h 内没有明显的变化，与两组对照 组的结果相似，说明 flg14 和 flg22D43A 不具有激发子活性。2、Flg22 及其衍生多肽诱导的海带雌配子体 ROS 组织学观察运用荧光探针 DCFH-DA 染色的方法，在荧光显微镜下对受 flg22 及其衍生 多肽侵染的海带雌配子体进行了 ROS 组织学观察。结果表明：在 20 μM 时，flg22 和 flg15 侵染的海带雌配子体细胞中观察到微弱的绿色荧光信号。在 20-200 μM 的浓度范围内，荧光信号随浓度提高而增强。对于 flg14，当浓度为 600 μM 时， 检测到绿色荧光信号，600-1000 μM 范围内信号强度随着多肽浓度的增加而增 加。而对于 flg22D43A，浓度高达 1000 μM 时仍没有观察到绿色荧光信号。ROS 组织学检测得到的结果与鲁米诺荧光检测结果相符合。3、Flg22 及其衍生多肽对海带雌配子体的生长抑制当浓度为 1 μM 时，flg22、flg15、flg14 和 flg22D43A 对海带雌配子的生长抑 制实验结果表明：培养 40 天后海带配子体的鲜重出现明显差异。flg22 和 flg15 侵染的海带雌配子体鲜重分别为 0.14