western blot实验技术及常见问题探讨-珍藏版.ppt.pptVIP

杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。 * 常用的封闭试剂有 5%的 BSA 或者脱脂奶粉，缓冲液一般选择 PBST 或者TBST。将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TBST稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡1小时。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TBST将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。 * 一般封闭条件为：室温或者 37℃缓慢摇荡1～2h，特殊情况也可 4℃过夜，根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。比如有时 BSA 比脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背景。封闭完成后要进行洗膜，以去除膜上未结合的封闭试剂。洗涤液使用TBST 或者PBST。 * 把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。加入用封闭液配制的二抗，摇