肠道病毒71型3cpro蛋白可视化重组病毒的构建与应用-微生物学专业论文 word格式.docx

摘要肠道病毒71 型（EV71）是小RNA 病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属（Enterovirus）的重要成员。EV71感染主要引起手足口病（Hand-Foot-Mouse Disease），可导致严重的神经系统综合症，是手足口病重症和死亡病例的主要原因。目前临床上尚无针对EV71的有效疫苗和特异抗病毒药物。EV71病毒基因组为单股正链RNA分子，包含一个单一读码框，编码4个结构蛋白（VP1，VP2，VP3，VP4）和7 个非结构蛋白（2A，2B，2C，3A，3B，3C和3D）。基因组5′和3′端为非编码区（untranslatedregion，UTR），5′UTR 内含有内部核糖体进入位点（IRES）等复制翻译调控元件，3′UTR 内含有三个茎环结构和PolyA 元件。非结构蛋白3C 蛋白酶（3Cpro）是病毒基因组编码的两个蛋白酶之一，主要负责除VP1-2A、VP2-VP4位点以外，病毒多聚蛋白其它位点的切割。此外，3Cpro还可对部分宿主蛋白进行切割，是病毒-宿主相互作用过程中的关键蛋白。但目前对于3Cpro在宿主细胞内的表达与转运机制尚不清楚，迫切需要明确3Cpro在感染过程中的时空动态分布情况，为后续研究奠定基础。利用反向遗传学技术，本研究构建了EV71国内流行株基因组全长感染性cDNA克隆，并对恢复病毒进行了鉴定；双砷-四半胱氨酸成像技术是近年来新兴的蛋白荧光标记技术，可以对带有CCPGCC多肽序列（TC 标签）的蛋白进行实时荧光成像，因此我们在全长感染性cDNA克隆的基础上构建了在3Cpro标记有TC标签的重组病毒，并对该病毒的生物学性质进行了鉴定；最后利用双砷- 四半胱氨酸成像技术对重组病毒进行了实时成像，获得了3Cpro在宿主细胞内表达与转运的动态图像，明确了3Cpro在感染细胞内的时空分布特征。1.EV71基因组全长感染性cDNA克隆的构建与鉴定首先，基于EV71国内流行株，构建了EV71基因组全长感染性cDNA 克隆。利用高保真DNA聚合酶，将病毒基因组进行全长RT-PCR扩增，同时在基因组5′端上游引入SP6 启动子序列和SnaB I单克隆位点，在3′端polyA下游引入Mlu I单克隆位点。然后将全长基因组经双酶切后克隆至基于pBR322载体改造的pEV 载体，酶切鉴定及核酸序列测定结果表明，构建了EV71国内流行株基因组全长克隆A12。为了鉴定基因组全长克隆是否能够拯救出具有感染性的病毒颗粒，将全长cDNA克隆线性化后进行体外转录，将转录产物利用电穿孔及脂质体法转染RD 细胞，获得恢复病毒。将恢复病毒在RD细胞上进行传代，接种后12 h即可观察到典型的细胞病变，与野生型病毒出现病变时间一致；间接免疫荧光鉴定结果显示，感染后6h的RD细胞中即可检测到病毒特异蛋白；蛋白印迹（WB）实验表明，恢复病毒能够表达病毒特异的衣壳蛋白。恢复病毒在RD细胞上能够形成蚀斑，蚀斑形态和出斑时间均与野生型病毒一致。一步生长曲线显示，恢复病毒的滴度在感染细胞48 h 后达到最高，滴度为107PFU/ml，证明恢复病毒的感染性与增殖活性与野生型病毒一致。此外，还对电穿孔和脂质体法拯救病毒的效率进行了比对，在850V 电压下进行电穿孔转染，细胞在转染后48 h 开始观察到病变，96h 后病变达到100%，但是同样量的RNA经脂质体转染后，12h即可观察到病变，48 h 后达到完全病变，表明脂质体法转染效率较高。以上结果表明，成功构建了EV71全长感染性cDNA克隆A12，可用于后续的基因改造工作。脂质体转染操作简便，转染效率高，首选脂质体法作为病毒拯救的手段。2.EV713Cpro蛋白实时可视化重组病毒的构建与鉴定为了利用EV71全长感染性cDNA克隆对3Cpro进行细胞内表达与转运研究，将多肽序列CCPGCC插入3Cpro181 位S 和182 位E之间，构建实时可视化的报告病毒。将获得的重组质粒进行体外转录并转染RD细胞，转染12 h后即可观察到EV71典型细胞病变，36h后病变完全；将恢复病毒在RD和Vero细胞上进行传代，24 h 后可见EV71典型细胞病变；将恢复病毒接种细胞后，利用间接免疫荧光和免疫印迹均可检测到病毒衣壳蛋白VP1 和3Cpro蛋白的表达，并且表达量随感染时间的延长而提高；恢复病毒在RD细胞上能够形成蚀斑，其蚀斑形态和出斑时间均与野生型一致；一步生长曲线结果显示，恢复病毒的增殖能力和野生型病毒基本一致。对连续传代后的病毒进行序列测定，结果表明，重组病毒基因组在传代过程中保持稳定，插入序列无突变或缺失。以上结果表明，成功获得了在3Cpro标记有TC标签的恢复病毒，该病毒的生物学性状与野生型病毒一致，其基因组序列稳定，插入的TC 标签能够稳定遗传。3.EV713Cpro蛋白在感染过程