利用重组蔗糖：蔗糖1-果糖基转移酶制备蔗果三糖的研究-化学工艺专业论文 word格式.docxVIP

摘要低聚果糖（Fructooligosaccharides,FOS）是指在蔗糖分子的果糖残基上通过β-1, 2糖苷键连接1-3个果糖基而成的蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）、蔗果五糖（GF4）及其它们的混合物。FOS是一种益生素，能刺激肠道中双歧杆菌生长，抑制外源致病菌和肠内固有腐败菌（如梭菌）的生长繁殖，维持肠道微生态平衡，提高机体的免疫功能等功效。研究表明GF2是FOS作为益生素的有效成分。作为益生元重要代表之一的FOS已成为国内外研究和开发的热点，被誉为集营养、保健、疗效三位一体的21世纪健康新糖源。植物来源的蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶（Sucrose:sucrose1-fructosyltransferase,1-SST）催化2分子的蔗糖转化成1分子的蔗果三糖和1分子的葡萄糖。本论文利用本实验室所构建的含1-SST基因的基因工程菌通过发酵工程技术获得重组1-SST，利用所产的重组酶体外转化蔗糖制备GF2，为下一步的工业上大规模生产GF2奠定基础。在单因素优化的基础上，利用DesignExpert7.0 实验设计软件对重组菌进行响应面设计优化发酵工艺。首先，通过PB实验，从蔗糖、酵母提取物、NH4Cl、KH2PO4、初始pH、接种量及装液量7 个因素中筛选出影响重组菌产酶的显著因素；然后，通过最陡爬坡实验最大限度地接近最佳产酶区。最后，通过中心组合设计实验得到最优条件。制备1-SST的最佳工艺条件为：蔗糖浓度0.6%、酵母提取物浓度0.3%、NH4Cl浓度0.3%、pH7.1，其它组分和浓度与原始PPB培养基相同。验证实验表明重组菌在优化后的发酵工艺中所产的酶活力为6.309U/mL，比优化前提高了55.5%。对粗酶液酶学性质的研究表明：1-SST的最适酶活反应温度范围为30-40℃，在此范围内有较好的温度稳定性，最适反应温度为35℃；1-SST的最适酶活反应pH范围为6.5-7.0，在此范围内有较好的pH稳定性，最适pH为6.5。不同金属离子对酶活力的影响不同，其中Ca2+、Fe3+和Al3+对重组1-SST的激活作用最明显，Zn2+则有很强的抑制作用。通过Lineweaver-Burk作图法，得到该酶的米氏常数Km为25.09 mmol/L。对粗酶液体外制备蔗果三糖的生产工艺进行了研究。首先，对体外反应的反应温度、不同pH缓冲体系和底物浓度进行优化；然后，在单因素的基础上，对pH、底物浓度以及温度进行3 因素3 水平的正交实验，该工艺的最优条件为反应温度33℃、底物浓度40 mg/mL以及pH6.7，并在此条件下得到蔗果三糖的最高产率为5.413mg/(mL·min)，比优化前提高了1.63 倍。关键词：蔗糖：蔗糖1-果糖基转移酶；发酵工艺；酶学性质；蔗果三糖的制备ABSTRACTFructooligosaccharide(FOS)consistsofamixtureoffructoseoligomerswithtwoor threefructoseunitsboundtotheβ(2→1)glycosidicbondofsucrose,whichismainly composed of1-kestose(GF2),nystose(GF3),fructofranosyl-nystose(GF4)andtheirmixture. FOSisapre-biotics.FOScanselectivelystimulatethegrowth ofbifidobacteriumandother beneficialflorainthegut,inhibitthegrowthofdetrimentalpathogensandclostridia.FOS playsanimportantroleinregulatinggastrointestinaltractfunction,preventingvarious diseasesandimprovingthehosthealth.Studies showedthat1-kestoseistheactiveingredient ofpre-bioticsFOS,whichisapplied byfood,healthcareproductsanddrug.Itisknownthat FOSisthenewsugarsourcein21century.Sucrose:sucrose1-fructosyltransferase(1-SST) catalysesthesynthesisof1-kestoseby transferringafructosylunitfromonesucroseto another. Inthisthesis,geneticallymodifiedyea