FAT荧光偏振免疫测定520530nm.ppt

第七章 荧光免疫技术 新疆医科大学第三临床医学院 临床检验教研室 冯阳春 教学要求 掌握有关荧光的基本知识和荧光抗体技术 熟悉荧光免疫测定的类型 了解荧光免疫技术在医学检验中的应用 教学内容 荧光免疫技术的特点 荧光抗体的制备 荧光显微镜基本原理 荧光免疫分析 荧光免疫技术的应用 第一节 荧光免疫技术的特点 荧光的基本知识 荧光物质 第二节 荧光抗体的制备 抗体要求 荧光素要求 荧光素标记抗体的方法 荧光素标记抗体的纯化 荧光抗体的鉴定 荧光抗体的保存 第三节 荧光显微镜基本原理 标本的制作 荧光抗体染色与结果判断 荧光显微镜的基本结构 第四节 荧光免疫分析 时间分辨荧光免疫测定 荧光偏振免疫测定 荧光酶免疫测定 第五节 荧光免疫技术的应用 荧光显微镜技术的应用 荧光免疫测定的应用 小结 荧光的基本知识 荧光及荧光技术中相关概念，常用荧光物质 荧光抗体技术 荧光抗体染色与结果判断 荧光免疫分析 时间分辨荧光免疫测定，荧光偏振免疫测定， 荧光酶免疫测定 1．发射光谱和激发光谱的概念是什么？ 2．常用的荧光物质有哪些？ 3．荧光免疫分析有哪些类型？ 4．荧光抗体技术的基本原理是什么？ 5. 荧光免疫测定有何应用？ 荧光免疫分析的基本原理 将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。 自发荧光寿命短:1ns～10ns 镧系元素寿命长:10μs～1000μs 短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光 基本原理 时间分辨检测原理示意图 时间分辨 时间分辨荧光免疫测定 stokes位移:激发光谱和发射光谱的波长差 镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱 和发射光谱不重叠 stokes位移 基本原理 时间分辨荧光免疫测定 发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少 激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏度高 基本原理 发射光谱和激发光谱 时间分辨荧光免疫测定 比活性：单位时间每个标记分子被探测的信号量 荧光激发光源1000次/S激发，比活性提高 基本原理 荧光标记物的相对比活性 时间分辨荧光免疫测定 结合β-二酮体 Eu3+解离 酸性增强液 荧光增强 Eu3+标记抗原抗体复合物 基本原理 信号增强 时间分辨荧光免疫测定 镧系元素 铕(Eu3+)（最常用） 钐(Sm3+) 铽(Tb3+) 钕(Nd3+) 镝(Dy3+) 标记物 1000 Dy3+-PTA 14 丹黄酰氯 714000 Eu3+-β-NTA 3.0 球蛋白 3.0 罗丹明B 96000 Tb3+-PTA 4.5 FITC 925000 Eu3+-PTA 3.5 细胞色素C 60000 Sm3+-PTA 4.1 人血清蛋白 65000 Sm3+ -β-NTA 1～10 非特异荧光背景 荧光寿命(ns) 荧光物质 荧光寿命(ns) 荧光物质 常见荧光物质的荧光寿命 时间分辨荧光免疫测定 标记方法 双功能螯合剂 1-（对-苯偶氮）-EDTA 异硫氰酸苯基-EDTA 异硫氰酸苯甲基-DTTA 二乙烯三胺五乙酸（DTPA） 标记方法： 一步法：先螯合Eu3+，再连接蛋白质 二步法：先连接蛋白质，再螯合Eu3+ 时间分辨荧光免疫测定 方法类型 双抗体夹心法 固相抗体竞争法 固相抗原竞争法 时间分辨荧光免疫测定 方法类型 时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图 双抗体夹心法 固相抗体和Eu3+标记抗体与待检抗原结合，形成固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物，酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发光下发射613nm荧光。 时间分辨荧光免疫测定 方法类型 固相抗体竞争法 待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。 时间分辨荧光免疫测定 方法类型 固相抗原竞争法 待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。 时间分辨荧光免疫测定 灵敏度高：最小检出量10-18mol/L 分析范围宽：4～5个数量级 标记物稳定：有效使用期长 测量快速，易自动化 易受污染，本底增高 方法评价 时间分辨荧光免疫测定 光线通过偏振滤光片后，形成一个方向的平面光称为偏振光。 偏振荧光(绿光,525nm～550nm) 偏振光(蓝光,485nm) 荧光物质 基本原理 荧光偏振免疫测定 抗原抗体竞争反应 AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱 AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强 若待检抗原多，则AgF-Ab少，AgF多，偏振荧光弱 待检抗原