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1. DNA连接酶 催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键 需要：3’-OH、5’-P以及NAD+或ATP做能源 不能连接两条单链DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA必须是双螺旋DNA分子的一部分 nick gap DNA连接的分子机理 连接反应的影响因素 1. 连接缓冲液的影响：合适酸碱度，pH的范围在7.4-7.8，较多用7.8；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。 2. ATP浓度的影响：连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，过浓会抑制反应。由于ATP极易分解，含有ATP的缓冲液应于-20℃保存，溶化取用后立即放回。最好小管分装贮存，防止反复冻融引起ATP分解。与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期保存），临用时加入新配制的ATP母液。 4、连接温度与时间的影响：因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，但连接酶的最适温度又恰为37℃。为了解决这一矛盾，在经过综合考虑后，传统上将连接温度定为16℃，时间为4-16h。对于平末端是不用考虑氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥。 5、载体与插入片段的量 适当的载体与片段的摩尔比能提高连接效率，并减少多拷贝插入片段的的形成，一般： 载体 插入片段 = 1 3-10 2. 粘性末端DNA的连接 DNA片段与载体用同一种内切酶酶切后，利用DNA连接酶将酶切形成的粘性末端连接起来 单酶切时如何阻止载体的自我环化？ 实验中普遍采用片段和载体用不同的酶双酶切形成不同的粘性末端，这种操作具有方向性 3. 平末端DNA的连接 直接用T4 DNA连接酶（需要ATP及高浓度酶） （1）同聚物加尾法 （2）衔接物连接法 双衔接物连接法 （3）DNA接头连接法 练习题 TMTC：too many to count 答案： 第三节 DNA聚合酶 DNA聚合酶能够把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。 1. DNA聚合酶I 在50年代的中期，A. Kornberg发现了DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymerase Ⅰ，DNA pol Ⅰ）原来称为Kornberg酶。以后又相续发现了DNA pol Ⅱ和DNA pol Ⅲ。 DNA聚合酶的共同特点是： （1）需要提供合成模板； （2）不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3 －OH； （3）合成的方向都是5→3； （4）除聚合DNA外还有其它功能。 冈崎片段 1.DNA聚合酶I（polI） 三种酶催活性： 5’-3’ 聚合酶活性 5’-3’ 核酸外切酶活性 3’-5’ 核酸外切酶活性 polI催化合成DNA的三种条件： （1）存在四种dNTPs和Mg2+ （2）带有3’-OH游离基团的引物链 （3）DNA模板（双链或单链） 链合成方向：5’ 3’ polI的5’ 3’聚合作用 polI的5’ 3’核酸外切酶活性（切除修复） 必须是位于双螺旋的区段上；切割部位既可以是末端也可以是距末端数个核苷酸远的磷酸二酯键；伴随发生的DNA合成可以增强5’-3’外切酶的活性；对双链DNA的单链缺口有活性但要存在5’-P基团。 用枯草杆菌蛋白酶切割成两个片段，一个片段36kDa具有5’-3’外切酶的活性;另一片段76kDa具有聚合酶活性及3’-5’外切酶活性，此即为Klenow片段。 第三章 基因克隆的酶学基础 1. 简述 核酸酶： 通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸键发生水解断裂的蛋白酶。分为两类：从核酸分子末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链的叫核酸外切酶（exonuclease）;从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫做核酸内切酶（endonuclease） 核糖核酸酶（RNase）：水解断裂RNA分子 脱氧核糖核酸酶：特异水解断裂DNA分子 核酸限制性内切酶和DNA连接酶是重组DNA技术赖以创立的酶学基础 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA连接酶—用于连接两条DNA分子或片段 反转录酶—以RNA分子为模板合成互补的cDNA链 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 多核苷酸激酶—将一个磷酸分子加到多核苷酸链的5’-OH末端 碱性磷酸酶—催化从DNA分子的5’或3’端移去末端磷酸基团 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用