8.蛋白质的分离纯化教学教案.ppt

②分子筛效应 大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。 蛋白质进入pH8.9的同一孔径的分离胶后，分子小且为球状的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面；反之，则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分成各自的区带。。 这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。 ③电荷效应 在pH8.9的分离胶中，各种带净电荷不同的蛋白质有不同的迁移率。净电荷多，则迁移快；反之，则迁移慢。因此，各种蛋白质按电荷多少、相对分子质量及形状，以一定顺序排成一个个区带。 4、SDS—凝胶电泳： 5、等电聚焦 (isoelectric focusing，IEF) 等电聚焦是60年代建立的一种高分辨率的蛋白质分离和分析技术。它是利用蛋白质分子或其他两性电解质分子具有不同的等电点，从而在一个稳定、连续、线性的pH梯度中得到分离。 近年来，等电聚焦电泳技术的分辨率有了很大提高，可以分辨pI只差0.01的生物大分子，这是等电聚焦最突出的优点， 蛋白质等电聚焦电泳的基本原理 在电泳支持介质中加入载体两性电解质(carrier ampholytes)，通以直流电后在正负极之间形成稳定、连续和线性的pH梯度，蛋白质在pH梯度凝胶中受电场力作用下泳动，它的分离仅仅决定于其本身的等电点。 当蛋白质分子一旦到达它的等电点位置，分子所带净电荷为0，就不能再迁移。如果它向等电点两侧扩散，净电荷就不再为0，都会被阴极或阳极吸引回来，直至回到净电荷为0的位置，因此蛋白质在与其本身pI相等的pH位置被聚焦成窄而稳定的区带。这种效应称之为“聚焦效应”。 保证了蛋白质分离的高分辨率，是等电聚焦最为突出的优点。 1、分辨率高，可以分辨pI只差0.01—0.02的生物大分子。 2、随着电泳时间的延长，区带越来越窄。其他电泳区带会越来越宽。 3、样品可以加在胶板的任何部位。 4、很稀的样品都可以分离，且重现性好。 5、可以用来测定蛋白质或多肽的等电点。 蛋白质等电聚焦电泳的特点 二、利用溶解度差别的纯化方法 影响蛋白质溶解度有： 自身因素：在同一的外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度，这是因为溶解度归根结底取决于它们本身的分子结构，例如分子所带电荷的性质和数量、亲水基团与疏水基团的比例，它们在蛋白质分子表面的排列以及由此而产生的偶极矩等。 外部因素：很多，其中主要有：①溶液的pH，②离子强度，③介电常数，④温度。 1. pH控制蛋白质的沉淀 蛋白质处于等电点时，其静电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。 不同的蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。 2. 蛋白质的盐溶和盐析 盐溶：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。 由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度增高 盐溶 盐析：当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质溶解度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析（salting out）。 大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。导致蛋白质表面的疏水基团的暴露 盐析（（NH4）2SO4 、 Na2SO4 ） 3．有机溶剂分级分离法 与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。 有机溶剂分级分离的机理 有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数。水是高介电常数物质(20℃时，80)，有机溶剂是低介电常数物质(20℃时，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4)，因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。这样，蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。 有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐析相似，与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚集而沉淀。 4．温度对蛋白质溶解度的影响 在一定温度范围内，约0～40℃之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加， 在40～50℃以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性pH介质中即失去溶解能力。 大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0℃或更低的温度下进行。 三、根据电荷不同的纯化方法 根据蛋白质的电荷不同即酸碱性