DNA重组的操作演示教学.ppt

生命科学学院 第六章 DNA重组的操作 外源DNA 载体DNA 重组分子 扩增或表达 表达 连接 转化或转导 电穿孔或显微注射 原核细胞 真核细胞 受体细胞 ？ 1.基因文库 2.PCR 3.基因差异表达 1.克隆载体 2.表达载体 第一节 DNA的体外重组 限制酶 —分子剪刀 限制酶 —分子剪刀 连接酶 —分子胶水 重组DNA分子 粘性末端连接效率最高！ 1、粘性末端的连接 第一节 DNA的体外重组 第一节 DNA的体外重组 1. 粘性末端连接 第一节 DNA的体外重组 1. 粘性末端连接 什么情况下可以产生粘性末端？ 同种酶 同尾酶 第一节 DNA的体外重组 （1）两端具有相同粘末端的DNA分子之间的连接 第一节 DNA的体外重组 　碱性磷酸酶：去掉其5’末端的磷酸基，以防质粒DNA的自身环化 。 注意： 目的基因正反向插入； 载体与多个目的基因片段重组。 1 2 3 1 2 3 4 4 3 4 第一节 DNA的体外重组 HindIII EcoRI HindIII EcoRI 对载体酶切 HindIII EcoRI 　对基因酶切 质粒载体的定向重组 碱性磷酸酶？ 避免了目的基因正反向插入 第一节 DNA的体外重组 　2. 平头末端连接 　（1） 直接连接 　　 T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。 5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。 　　　 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ -OH -OH -P -P P- P- HO- HO- 5’ 3’ -OH -P P- HO- 5’ 3’ 3’ 第一节 DNA的体外重组 　（2） 人工加尾形成 “粘性末端” 　　 a）同聚加尾 法 　　　 DNA末端转移酶 DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸, 利用DNA末端转移酶分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。 　　 第一节 DNA的体外重组 非酶切位点 　　 a）同聚加尾法 缺点：不能把插入片段再切下来。 第一节 DNA的体外重组 还有哪些方法能够创造粘性末端？ 第一节 DNA的体外重组 b）衔接物(linker)连接 　　　Linker:用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。 　　 GGAATTCC CCTTAAGG EcoRI linker： 第一节 DNA的体外重组 衔接物(linker)连接 第一节 DNA的体外重组 衔接物(linker)连接 优点： 1）可以用内切酶把插入片段切下来。 2）能给载体连接上Polylinker 缺点： 如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段 第一节 DNA的体外重组 c) DNA接头 (adapter)连接法 adapter:一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。 adapter的作用:用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。 5‘p-GATCCCGG-OH3’ GGCC-p5’ BamHI adapter 第一节 DNA的体外重组 缺点：接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。 防止自我连接： 先用碱性磷酸酶（CIP）处理接头 以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。 DNA接头 (adapter)连接法 平头末端连接 （1） 直接连接 （2） 人工加尾形成 “粘性末端” a)同聚加尾法 b)衔接物连接 c) DNA接头连接法 小结 PCR? 第一节 重组DNA分子的构建 　3.PCR产物的连接 　（1）在引物的5’端设计酶切位点 GCAGAATTC 互补序列 3’端15~20bp与模板互补； 5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列 （5’端多余的3~5bp属保护碱基） 引物 第一节 DNA的体外重组 引物1 　　GCAGAATTC 互补序列 模板 EcoRI位点 5’- -3’ GCAGAATTC 互补序列 5’- -3’ 3’ 模板 GCAGAATTC 互补序列 PCR产物 5’- -3’ 3’ 复性 延伸 模板 模板 3’ 第一节 DNA的体外重组 GCTAGCCGG 互补序列 模板 BamH I 位点 -5’ 3-’ 复性 延伸 模板 模板 3’ 3’ GCTAGCCGG 互补序列 3’- 模板 GCTAGCCGG PCR产物