生化实验设计自制.ppt

2012级本科生化及分子生物学实验设计 年级、专业、班级：2012级临床 实验课时间：2013.6.19 实验室： 组别： 组员排名：（排名不分先后） 报告人： 案例： 患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。 临床表现： 体格检查为体温38℃，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。实验室检查：红细胞 1.98×1012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5µmol/L，结合胆红素13.7µmol/L，未结合胆红素71.8µmol/L，尿蛋白（++），潜血(+)，尿胆红素(－)，尿胆素原(+)，尿液镜下未见红细胞。 1.根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？ 2.请设计实验进一步明确诊断。 　　　要求：实验名称，实验方法，主要试剂和仪器，实验操作流程及注意事项，结果如何分析。 3. 从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。 4. 要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基因? 5. 患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？ 1.根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？ 答：根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿患 急性溶血贫血症——蚕豆病 。 蚕豆病的症状：在生吃蚕豆后数小时至数日（1-3日）内突然发热、头晕、烦躁、恶心，尿呈酱油样或葡萄酒色，一般发作2—6天后能自行恢复，但若重者不及时抢救，会因循环衰竭危及生命。与上述患儿的临床表现大致相同，所以初步判定该病为蚕豆病。 蚕豆病简介 G6PD缺乏症俗称蚕豆病，是遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症是最常见的一种遗传性酶缺乏病。 发生机制：有遗传缺陷的敏感红细胞，因G6PD的缺陷不能提供足够的NADPH以维持还原型谷胱甘肽（GSH）的还原性（抗氧化作用），在遇到蚕豆种某种因子后更诱发了红细胞膜被氧化，产生溶血反应。G-6-PD有保护正常红细胞免遭氧化破坏的作用，新鲜蚕豆是很强的氧化剂，当G-6-PD缺乏时则红细胞被破坏而致病。 2.设计实验进一步明确诊断 根据蚕豆病的诊断原理本组设计的实验检查高铁血红蛋白还原试验来进一步明确诊断 实验名称 高铁血红蛋白还原法 实验原理： 正常血红蛋白是亚铁血红蛋白，可被亚硝酸氧化为高铁血红蛋白。当红细胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶含量正常时，通过戊糖循环形成的还原型辅酶Ⅱ可作为血液中高铁血红还原酶的辅酶，并在递氢体美蓝的参与下，使形成的高铁血红蛋白还原为亚铁血红蛋白。当红细胞内缺少葡萄糖-6-磷酸脱氢酶时，则高铁血红蛋白不能被还原。高铁血红蛋白为灰暗色，在630~650nm波长处吸光度最高，故可加以测定。 实验方法： 本试验用亚硝酸钠使HbFe++氧化为HbFe+++（暗棕色）以美蓝的递氢作用加强磷酸戊糖旁路的糖代谢。如果红细胞内G-6PD含量正常，则有足量NADPH产生，它作为高铁血红蛋白还原酶的辅酶，在美蓝（递氢体）参与下使HbFe+++很快还原成HbFe++。GSSG还原成GSH：如果红细胞缺乏G-6PD则NADPH生成减少，HbFe+++还原成HbFe++也减少，本试验即以高铁血红蛋白还原率来反映NADPH生成状况而间接测知G-6PD是否缺乏。 主要试剂: （1）12.5g/mL亚硝酸葡萄糖溶液 取亚硝酸纳1.25g，葡萄糖5g，蒸馏水加至100ml。 （2）0.0001mol/L美蓝溶液 取美蓝0.15g，蒸馏水加至100ml。 （3）0.02mol/L磷酸盐缓冲溶（PH7.4） 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）51mg，磷酸二氢钾52.2mg，加蒸馏水至100ml。 主要仪器： 可见分光光度计 离心机 恒温水浴箱 移液器 小试管 实验操作流程 ： （1）静脉取血1.5~2.0ml，加于含有3.8%柠檬酸钠抗凝剂的小试管内，血液和抗凝剂按9:1混合，加葡萄糖20mg。 （2）将此标本离心沉淀5min（ 1000 r/min）或放置4℃冰箱过夜，待红细胞下沉后吸去部分血浆，使红细胞与血浆比列约为1:1（相当红细胞比容35%~40%）。 （3）摇匀后取此血液1ml，加12.5g/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液和0.0001mol/L美蓝溶液各0.05ml，颠倒混合15次，使与空气中的氧气充分接触，加塞，置于37℃水浴（或保温箱）3h。 （4）取出后摇匀，吸取此液0.1ml，加于0.02mol/L磷酸盐缓冲液10ml中，2min