稳定抑制PAK2蛋白表达的HUH-7细胞株的建立朴莲淑王福光于庆功.DOC

稳定抑制PAK2蛋白表达的HUH-7细胞株的建立 朴莲淑 王福光 于庆功 王迎春 王飞 大连大学附属中山医院消化内科辽宁大连116001 [基金项目 国家自然科学基金 [摘要] 目的 为研究细胞周期相关因子PAK2在原发性肝癌中的作用，拟用shRNA干扰技术建立稳定抑制PAK2蛋白表达的HUH-7肝癌细胞系。 方法 用基因转染技术将人PAK2的3个shRNA片段分别克隆至慢病毒载体pHBLV-U6-ZsGreen-Puro，包装成病毒后利用脂质体将载体病毒转染至HUH-7细胞，利用G418筛选稳定表达shRNA细胞。利用Real-time PCR和Western bloting方法分别鉴定转染细胞内PAK2的RNA及蛋白表达水平。 结果 sh1-PAK2 HUH-7、sh2-PAK2 HUH-7和sh3-PAK2病毒载体均可转染至HUH-7细胞系，且转染效率较高＞80%Real time-PCR结果显示，对照sh-cont比转染sh1-PAK2、sh2-PAK2和sh3-PAK可明显抑制HUH-7细胞内PAK2-mRNA的表达，（P ＜ 0.05），其中sh2-PAK2和sh3-PAK2的干扰效果尤为明显，下调效率分别达68%和89%。Western blotting结果显示转染sh3-PKA2细胞内PAK2蛋白表达量较对照组sh-cont明显下调，表