液相色谱议操作过程.pptVIP

高效液相色谱法： 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测） 高效液相色谱与气相色谱差别 1．分析对象的区别 气相色谱：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测，占有机物的20%。 高效液相色谱：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测， 用途广泛，占有机物的80%。 2．流动相差别的区别 气相色谱：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。 高效液相色谱：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。 3．操作条件差别 气相色谱：加温操作 高效液相色谱：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 液相色谱仪的工作原理 混合物中各组分在固定相和流动相之间会发生吸附、溶解或其他亲和作用，这种作用存在差异，从而使各组分在色谱柱中的迁移速度不同得到分离 液固吸附色谱法分离机理 2 高压泵 主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10μm）， 液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高 压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。 高压梯度 将溶剂用高压泵增压后输入色谱系统的梯度混合室，加以混合后送入色谱柱。 3 示差折光检测器 除紫外检测器之外应用最 多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种。 三 液相色谱的固定相与流动相 液相色谱的固定相： ? 液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。?? 正相柱：固定液极性 流动相极性，多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3—10 μm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。?? 反相柱：固定液极性 流动相极性，主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。?? 常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3—10 μm之间。 1 液相色谱的流动相 流动相特性 （1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动 相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况； （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极 性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正 相柱。 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液 液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上 的出峰顺序相反。 选择流动相时应注意的几个问题 （1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱 子。如使固定液溶解流失，如酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并 在柱中沉积。 （4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测 器时，流动相不应有紫外吸收。 四 主要分离类型与原理 一、液-固吸附色谱 固 定 相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。 流 动 相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。 液-液分配色谱 固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性，反之，流动相的极性大于固定液的极性。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液