第三章 分子克隆的载体.ppt

?表达和分离提纯 在pTWIN1中，当外源目的基因插入多克隆位点并带有自身的翻译终止密码子时，可表达出在目的蛋白末端带有CBD和intein1的融合蛋白。 表达该融合蛋白的细胞抽提物流过几丁质树脂层析柱时，融合蛋白就被吸附在树脂上 通过洗涤可将其它蛋白除去 调节层析柱的pH至7.0并于室温放置，目的蛋白与intein之间发生水解 通过洗脱便得到纯化的目的蛋白 （5）分泌型表达载体 　除了在细胞内表达外，还可让表达的蛋白分泌到细胞外或细胞周质区中。 可避免细胞内蛋白酶的降解，或使表达的蛋白正确折叠，或去除 N-- 末端的甲硫氨酸，从而达到维护目标蛋白活性的目的。 ????利用信号肽序列作为融合标签可将融合蛋白分泌到细胞外，可利用的信号肽有碱性磷酸酶的信号肽和蛋白质 A 的信号肽。???? YAC 载体功能强大，但有一些弊端。这主要表现在 3 个方面： 在 YAC 载体的插入片段会出现缺失 （deletion） 和基因重排 （rearrangement） 的现象 容易形成嵌合体。嵌合就是在单个 YAC 中的插入片段由 2 个或多个的独立基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的 5%～50% YAC 染色体与宿主细胞的染色体大小相近，影响了 YAC 载体的广泛应用 二、细菌人工染色体载体 （Bacterial artificial chromosome, YAC） 1．F 质粒????大肠杆菌的 F 因子是一个约 100kb 的质粒。它编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质（Willetts and Skurray，1987）。虽然F因子通常以双链闭环DNA（1-2个拷贝/细胞）的形式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少30个位点处进行随机整合（Low，1987）。携带F因子的细胞，或以游离状态或以整合状态表达三根发样状的F菌毛。F菌毛为供体与受体细胞之间产生性接触所必需。 2．细菌人工染色体????是基于大肠杆菌的 F 质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。每个环状 DNA 分子中携带: 一个抗生素抗性标记 一个来源于大肠杆菌 F 因子（致育因子）的严谨型控制的复制子 oriS （ Shizuya et al. 1992 ） 一个易于 DNA 复制的由 ATP 驱动的解旋酶（RepE） 三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座 （ parA , parB , 和 parC ） 。 BAC 载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。 Structure of a bacterial artificial chromosome (BAC), used for cloning large fragments of donor DNA. CMR is a selectable marker for chloramphenicol resistance. oriS, repE, parA, and parB are F genes for replication and regulation of copy number. cosN is the cos site from l phage. HindIII and BamHI are cloning sites at which foreign DNA is inserted. The two promoters are for transcribing the inserted fragment. The NotI sites are used for cutting out the inserted fragment. 三、P1噬菌体载体和P1人工染色体载体 P1 phage vectors and P1 artificial chromosome vectors?(PAC) 1.P1 噬菌体载体（P1Bacteriophage vectors）????基于 P1 噬菌体构建的，与黏粒载体工作原理比较相似的一种高通量载体。它含有很多 P1 噬菌体来源的顺式作用元件，能容纳 70～100kb 大小的基因组DNA片段 P1噬菌体载体的工作原理 2．P1 人工染色体（P1 artificial chromosomes）???? ????结合了 P1 载体和 BAC 载体的最佳特性，包括阳性选择标记 sacB 及噬菌体 P1 的质粒复制子和裂解性复制子。 用这样的载体构建基因组文库时,重组分子不能通过体外包装来感染宿主细胞，在载体连接过程中产生的环状重组 PAC 只能用电穿孔的方法导入大肠杆菌中，并且以单拷贝质粒状态维持 基于 PAC 的人类基因组文库插入片段的大小在 60kb～150kb 之间。 第六