疟原虫的镜检技术--.ppt

疟原虫的镜检技术 山东省寄生虫病防治研究所 疟疾的实验室诊断 1.病原学诊断：显微镜血涂片查见疟原虫，这种镜检确诊最可靠。 2.免疫学诊断：（1）循环抗原的检测 （2）循环抗体的检测 3.分子生物学技术：PCR和DNA探针已应用于疟疾的诊断。 分子生物学、血清学技术发展迅猛，但是确诊疟疾的“金标准” 仍然是血液显微镜检查。 疟原虫的镜检技术 1. 血膜制作与染色。 2. 厚、薄血膜中间日疟、恶性疟各期疟原虫的形态结构及其鉴别要点。 3. 镜检示教。 血膜的制作（所需设备） 1.载玻片：新玻片浸入有液态洗涤剂的清水中10-20分钟，干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净，晾干，最后用干净柔软的棉巾将玻片擦亮。已用过的玻片浸泡于洗涤剂溶液中1-2天，或浸泡于煮沸的5%肥皂水中1-2小时，再放入新配置的洗涤剂溶液中1-2小时，逐个擦去血膜痕迹，清水漂洗干净，擦亮。 2. 采血针：一次性 3.玻片盒：防止污染和昆虫吸食血膜 4.75%酒精棉球：采血前后消毒 5.记号笔：玻片上书写号码 血膜的制作（取血时间） 采血时间 现症病人和流调普查时可不考虑取血时机，但在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。 疟疾典型的临床表现分前驱期、发冷（寒战）期、发热期、出汗期和间歇期五期。 间日疟在前驱期相当于肝内期疟原虫发育，因原虫密度太低，镜检多为阴性；发冷（寒战）期相当于红内期成熟裂殖体胀破红细胞期，镜检多见裂殖体和环状体；发热期外周血中以环状体（小滋养体）为主；出汗期因原虫密度太低，镜检多为阴性；发作后数小时（h），间歇期外周血中以大滋养体为主，形态较易辩认，为诊断的有利时机。发作36-48h，可检出裂殖体；发作1-2次后，配子体出现较多。 恶性疟较理想的取血时间是在发作后20h内取血，初发患者退热后常查不到原虫。 取血部位和方法 耳垂或无名指，通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅（1～2mm为宜）。然后用左手大拇指、食指和右手中指协同轻轻挤压出血滴。 血膜的制作 用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂成薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂成圆盘状，称厚血膜。最好一张玻片上同时制作厚、薄两种血膜。 薄血膜涂片操作 薄血膜 取洁净的载玻片1张，左手持载玻片平置,右手持推片，推片一端边缘的中点刮取血液1.0~1.5微升（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片中线接触，待血液向两侧扩展约2cm宽时，以25°～35°夹角均匀而迅速地向左推成舌状薄血膜（约2.5cm长）。 也可载玻片平置在桌面上操作 厚度以薄血膜上的红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳。 厚血膜涂片操作 用推片的一角刮取4~5微升血量（相当于火柴头大小），使血滴涂于载玻片的中央偏右处，由里向外一个方向旋转2~4圈，涂成直径0.8~1.0cm的圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求（厚度以1个油镜视野内可见5~10个白细胞为宜）。 标准的疟疾厚薄血膜片位置 血膜的制作（编号） 血膜编号 血膜制成后，立即在玻片面上写上受检者的号码，以防差错；待薄血膜干后再用铅笔于薄血膜中写上受检者的个人编号，依次按顺序插入标本盒内。 制作血膜注意事项 1.清洗玻片，且勿碰撞、磨损 载玻片必须完全清洁无油渍或污垢。制片时，手指勿接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白区以及厚血膜脱落。作为推片的玻片边缘一定要平滑，才能使推出的血膜均匀一致。 2. 刚涂制的血膜要平放在标本盒内 厚血膜未干前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不易溶血和着色而影响检查结果；晾干血膜时应注意防尘，防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜；干后应及时装入标本盒并盖严。 3.血膜应自然干燥 切忌在毒太阳下晒或火烤，加快其干燥可采用手上或衣服摩擦、风吹，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可能24-48h内固定染色；冬天也不能超过72h。放置时间越久，厚血膜越不易溶血，染色效果也差。若不能及时染色，薄血膜宜先用甲醇固定（1～3分钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干后装入盒内盖严，待以后染色。 染液的种类 染液种类：目前临床上应用最广泛的是瑞氏（Wright stain）和吉氏染液（Giemsa stain）。这些染液中的主要染剂都包含美蓝、伊红和由美蓝氧化所成的天青，所以称多色性染剂。我们主要用吉氏染液，它具有方便、染色效果稳定、便于长期保存的优点。瑞氏染液染色时间短，但染色效果不如吉氏稳定，主要在门