第四章细胞碎片与包含体产品 课件.pptVIP

路线2 的特点 路线2应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质。 优点是封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少。 缺点：细胞碎片和包含体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白质的滞留。 包涵体获得几种常见的工艺路线（三） 化学破碎 （加变性剂） 离心除细胞碎片 除变性剂复性 路线3的特点 用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。 缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难。 蛋白质的复性 不溶性包含体：离心,收集菌体→细胞破碎→离心,收集沉淀→包含体洗涤→目标蛋白变性溶解→复性→纯化。 inclusion bodies IBs 复性步骤: 用脲或盐酸胍等变性剂溶解包涵体使其变成伸展的肽链结构。 脱除变性剂，使伸展的肽链折叠成正确的空间结构。 1）包涵体的洗涤 细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。 洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。 洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。 洗涤剂浓度:以溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原则。 2）目标蛋白的变性溶解 包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性才能使其形成可溶性的形式。 常用变性剂： 5-8 mol/L盐酸胍和6-8 mol/L尿素, 作用：破坏离子间相互作用； 表面活性剂如1-2％ SDS， 作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。 pH9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少。 影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和浓度。 3） 目标蛋白的复性 原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。 复性方法： 稀释法除变性剂 － 加入大量水或缓冲液。 膜分离法除变性剂 － 透析、超滤、电渗析。 层析法：凝胶层析，高效疏水层析 蛋白质复性影响因素： 变性剂浓度 目标蛋白浓度； pH和离子强度； 氧化还原条件。 还原剂： 二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、 还原型谷胱甘肽； 氧化剂： 氧化型谷胱甘肽; 碱性下通空气。 复性区 多聚物生成区 絮凝沉淀区 盐酸胍浓度mol/L 红血球碳酐酶复性操作中变性剂 与蛋白质浓度对复性的影响 蛋白质浓度 mol/L 提高复性成功率采取措施： 在低浓度下进行蛋白质复性（稀释 复性) 膜分离法脱除变性剂 加入凝集抑制剂 加入分子伴侣 层析复性（吸附和凝胶过滤色谱） 反胶团萃取 双水相萃取 （1）稀释法 将溶液稀释，降低变性剂浓度，使蛋白质复性： 水或缓冲溶液（蛋白质生理pH，50倍） ↓ 变性溶液(6mol/L)→稀释液(0.12 mol/L) ↓ 部分蛋白质复性 稀释复性 10～50?g/ml 缺点：降低蛋白质浓度势必增大蛋白质溶液体积,给后续的分离纯化增加困难，耗费大 解决办法：将流加操作引入复性过程,即以流加的方式向复性缓冲液中输入变性蛋白质。由于在流加的同时复性液中的蛋白质发生折叠复性,使变性蛋白质浓度始终保持在较低的水平,可在较高的蛋白质终浓度下获得高复性收率。这种复性方法在变性溶菌酶复性中得到了验证。 2、膜分离法脱除变性剂 膜分离法中可采用透析、超滤或电渗析等除去变性剂。此法不会增加料液体积和降低目标蛋白浓度，克服了稀释法的缺点 。 缺点：透析法耗费时间较长，易形成蛋白质沉淀。超滤和电渗析速度较快，由于剪切力，容易使蛋白失活，且易引起膜污染，操作时应注意。 3、加入凝集抑制剂 由于分子间疏水性作用导致的聚集体生成是影响蛋白质复性收率的主要原因,加入凝集抑制剂抑制聚集体的生成,从而开发了“添加稀释”复性技术。甘油、聚乙二醇、表面活性剂、单克隆抗体和丙酮；另添加肽基 脯氨酰基顺反异构酶、Ｌ 精氨酸和谷胱苷肽等促使蛋白质某些结构位点(如二硫键)的形成,也可促进蛋白质折叠复性。 缺点：体系中增加新物质，增加后续纯化难度。 4、加入分子伴侣 分子伴侣(一