第九章核酸的分离与相关提纯.ppt

去此类高分子物质常用的方法有: 如果核酸不是采用酚法制备的，可在对氨基水杨酸等化合物存在的条件下，将核酸制品连续用苯酚进行处理，此时DNA和RNA均进入水相，蛋白质沉淀留在酚相。然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA，也可以用酚或SDS反复摇荡抽提。 如果是用酚法制得的核酸，则大部分蛋白质已被除去，若要进一步除去其中的微量蛋白，可用氯仿/异戊醇或辛醇振荡抽提，同时加热处理使蛋白质凝固形成沉淀，离心分离，核酸即留在溶液中。 第二个方法是Kirby创建并经Ralph和Bellamy等改良的有机溶剂法。即在pH8的1.25mol/L磷酸缓冲液中，用2-甲氧基乙醇抽提，多糖溶于水相，核酸在有机相，加入CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)沉淀核酸，然后在70%乙醇中用醋酸钠处理，以钠盐的形式回收核酸。 此外，也可以用钙盐沉淀DNA，再用草酸钾处理形成DNA钾盐回收，然后用离子交换层析法吸附DNA使之与多糖分离。 3．不同类型核酸的分离 通常可采用酶处理、有机溶剂抽提、盐分步沉淀和密度梯度离心等方法。 从DNA中除去RNA的有效方法是利用RNase选择性地降解RNA。但由于RNase中常含有极微量的DNase，因而必须先将RNase试剂于80～100℃)加热处理5～10min。 反之，为了从RNA制品中除去DNA，可加入DNase降解DNA，加入的酶则利用酚法除去。 其他除去DNA的常用方法是苯酚抽提法。 4．同类核酸的分离 在初步纯化的RNA制品中，常含有各种RNA和某些降解RNA的混合物； 在DNA制品中则往往含有变性或降解的DNA， 通常多采用梯度离心、电泳、柱层析及反复萃取抽提等方法进一步纯化或分级分离。 五、超离心技术在核酸分离中的应用 核酸的分离和纯化，通常采用密度梯度离心法。密度梯度离心是一种带状分离法。 密度梯度离心法包括密度梯度差速离心、等密度离心和浮力密度梯度离心。 梯度溶液所使用的成分有蔗糖、甘油、氯化铯、氯化铷、右旋糖酐和蔗糖多聚物等。 这些物质本身对核酸、蛋白质等具有化学惰性，因此不会导致其分子间的聚集，而且由于这些物质的黏性大，可以维持重力的稳定性，防止由于局部温度变化或机械振动所产生的对流,起着稳定离心液保证分离效果的作用. 第三节 DNA与RNA的制备 一、供体DNA的分离与纯化 要求：尽可能地保持其高分子量，无其它污染物. 1、?基因组大小： 染色体 细菌 3300~4200kb 酵母 15,000 kb 果蝇 1.28x105 kb 人 3x106 kb 植物 2x105~1x108 kb 天花病毒 288 kb 痘病毒 196 kb 质体 几~100以上kb 线粒体 藻类 线状 15kb 酵母 环状 19~78 kb 植物 环状 100~150 kb 动物(扁虫到人)环状 15~18 kb 锥虫 网状 6000 kb(幼体) 短膜虫 网状 30,000 kb(幼体) (Kinetoplast） 叶绿体 双子叶植物 121（菠菜）~154kb（豌豆） 单子叶植物 151（玉米）~182kb（浮萍） 藻类 132（裸藻）~191kb（衣藻） 1、 DNA分离纯化过程 破碎细胞 + DNA抽提液(EDTA、去污剂、还原剂) 65℃温育 20’ 冰浴冷却 离心去细胞碎片 苯酚抽提法① CsCl密度梯度离心② 2) CsCl密度梯度离心 上清液 加入固体CsCl与EtBr溶液 室温下超速离心(45,000rpm）16小时 穿孔取出DNA（320nm） 异丙醇抽提溴乙锭 缓冲液透析除去残余CsCl 两倍体积冷乙醇沉淀DNA 离心、洗涤、干燥