第六章生物催化剂的修饰与改造-教材课件.pptVIP

第六章 生物催化剂的修饰与改造;酶的结构和功能;全酶;酶蛋白分子水平的改造;酶分子的研究：认识和改造;生物催化剂的化学修饰;酶分子的修饰目的;1、研究酶的空间结构 2、确定氨基酸残基的功能 3、测定酶分子中某种氨基酸的数量 化学修饰在酶结构与功能研究中的应用除了以上三方面外，在测定酶的氨基酸序列和研究变构酶时也能有不凡的表现。;;生物大分子酶，组成单位主要是氨基酸和核苷酸。AA通过肽键连接成肽链，在通过盘绕折叠形成完成的空间结构。蛋白类酶的主链-肽链，是酶分子结构的基础。主链一旦改变，酶的结构和特性将随之发生改变。 主链的切断和连接-主链修饰：切断-酶原的活化，连接-1个酶分子上具有两种或多种催化活性的多酶融合体。 侧链的修饰：羧基的化学修饰、氨基、精氨酸胍基、巯基、组氨酸咪唑基、色氨酸吲哚基、酪氨酸残基和脂肪羟基、甲硫氨酸甲硫基的化学修饰;酶蛋白的固定化方法修饰;酶蛋白的反胶束修饰;大分子修饰剂的化学修饰;用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。 每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍； 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍 ;大分子修饰(共价)的过程;PEG、单甲氧基聚乙二醇（MPEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸（PAA）、葡聚糖、CD、羧甲基纤维素等可溶性分子。 分子量500-20000的PEG类修饰剂应用最广，PEG分子末端有 2个-OH，两亲分子，无毒，没有免疫原性。 如：辣根过氧化物酶用MPEG共价修饰后，极端pH下抗变性能力提高，耐热性提高。 如：MPEG修饰的过氧化氢酶在有机溶剂中，溶解性和酶活提高，耐热性提高，在三氯乙烷中酶活提高200倍，水溶液中酶活力提高15-20倍。 不足：影响酶活性中心，必须事先了解酶活性部位的结构、或采取措施保护酶活性部位。;小分子修饰剂的化学修饰;侧链基团修饰;氨基修饰;羧基修饰 ;巯基修饰;胍基修饰;酚基修饰;咪唑基修饰;吲哚基修饰;分子内交联修饰;酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰);;酶分子的物理修饰 ;酶修饰后的性质变化;酶的金属离子置换修饰;α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+) 酶活提高：α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+）：发酵生产、保存和应用中，添加一定量Ca，有利提高和稳定其活力；Zn型蛋白酶（Zn—Ca置换）--Ca型蛋白酶，活力提高30%。 稳定的改变：Fe型SOD置换成Mn-SOD，其对过氧化氢的稳定性显著提高，对叠氮钠（NaN3）的敏感性显著降低。 动力学特性改变：酰基化氨基酸水解酶活性中心的Zn被Co置换后，N-氯-乙酰丙氨酸水解最适pH8.5降到7，Km增大，;金属离子置换修饰的过程 ;酶分子修饰的基本要求和条件 ;酶分子修饰的条件;酶的组成单位置换修饰;氨基酸或核苷酸的化学置换修饰;核苷酸定位突变技术置换修饰;定位突变技术用于酶分子修饰的主要过程;①新的酶分子结构的设计 根据已知酶RNA或酶蛋白的化学机构和空间结构及特性，特别是根据酶在催化活性、稳定性、专一性等存在的问题，设计出想获得的新酶RNA的核苷酸排列次序或酶蛋白的氨基酸排列次序，确定想置换的核苷酸或氨基酸及其位置。;;③突变基因的获得 根据突变基因的剪辑序列及其需要置换的碱基位置，首先用DNA合成仪合成有1-2个碱基被置换了的寡核苷酸，再以此为引物通过PCR扩增获得大量的突变基因（寡核苷酸诱导的定位突变） ④新酶的获得 上述定点突变获得的突变基因体外重组，插入到适宜的基因载体中，然后进行转化、转导、介导、基因枪、显微注射等技术，转入到适宜的宿主细胞，再在适宜的条件下进行表达，获得经过修饰的新酶。 ;;定点突变的局限;1、某些修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂； 2、化学修饰后的酶构象或多或少都有一些改变，这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释； 3、酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，目前还不能用化学修饰的方法研究其他氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用； 4、酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，但尚缺乏准确性和系统性。;生物催化剂的定向进化dierected evolution;定向进化原理：对单一酶分子基因进行定向进化为例，在待进化酶基因的PCR扩增反