第十六章_基因工程及其在医学中的应用介绍.pptVIP

第十六章 基因工程及其在医学中的应用;第 一 节 基因工程;目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）;基因工程基本原理;基因工程操作流程;基因工程载体 制备的目的基因或外源性DNA片段必须与合适的载体连接形成重组体，才能进入受体细胞并进行复制和表达。 载体：指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为DNA。 ;基因工程载体的一般要求;;1. 质粒 (plasmid);;pUC18/19;λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）;;病毒载体 质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。 目前病毒载体常用包括：如腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转入病毒载体、慢病毒载体以及用于昆虫病毒表达的杆状病毒载体等。;目的基因的获取; 条件： 已知目的基因核酸序列或蛋白质序列。 基因较小 ;人工合成基因的局限性;二、基因组文库的构建; 三、 cDNA文库的构建;cDNA文库的构建：; ; 基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。 cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的DNA。;四、聚合酶链式反应（PCR） ;PCR基本原理;PCR反应体系;PCR 热循环;载体DNA与目的基因的连接;限制性核酸内切酶;Bam HⅠ;DNA连接酶 1、大肠杆菌DNA连接酶：只能连接粘性末端 2、T4DNA连接酶：既能连接粘性末端，又能连接平末端 ;DNA连接酶作用模式图;1. 粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接;Bam HⅠ切割反应;不同限制酶切位点的连接;同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。;5′ 3′;人工接头(linker)连接 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 ;人工接头及其应用;2. 平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端;目的基因;重组DNA分子引入受体细胞;一、转化 外源DNA进入细胞（常指原核细胞如细菌）而使遗传性改变称为转化。 指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程。 DNA进入细胞的效率很低，在分子生物学和基因工程工作中可采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易接受外界DNA，称为感受态细胞，再与外源DNA接触，就能提高转化效率。 ;二、转染;三、感染 噬菌体进入宿主细菌，病毒进入宿主细胞中繁殖就是感染（infection）。用经人工改造的噬菌体活病毒作载体，以其DNA与目的序列重组后，在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA包装成有活力的噬菌体或病毒，就能以感染的方式进入宿主细菌或细胞，使目的序列得以复制繁殖。感染的效率很高，但DNA包装成噬菌体或病毒的操作较麻烦。 ;重组体的筛选和鉴定;一、遗传标记筛选 1. 最常见的载体携带的标志是抗药性标志，如抗氨芐青霉素（ampr）、抗四环素(terr)、抗卡那霉素(kanr)等。当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖，这就把凡未能接受载体DNA的细胞全部筛除掉了。 ;;(插入失活法) 抗药性标记选择;2.营养缺陷型的互补筛选;DHFR缺陷 型CHO; α 互补的检测 ;;二、酶切鉴定;三、核酸分子杂交法　　;四、免疫鉴定 利用特定抗体与目的基因表达产物特异性结合的作用进行筛选。此法不是直接筛选目的基因，而是通过与基因表达产物的反应指示含有目的基因的转化细胞，因而要求实验设计要使目的基因进入受体细胞后能够表达出其编码产物。 ;五、PCR法;六、核苷酸序列测定;重组DNA技术操作的主要步骤;目的基因的表达;原核表达载体;原核细胞重组蛋白的表达、分离和纯化;真核表达体系;常