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蛋白质的分离纯化（SDS电泳） 报告人：左圣升 韩东升 宋昊东 PART 1 化1003班 左圣升 蛋白质 蛋白质是由氨基酸组成的生物大分子，其理化性质一部分与氨基酸相同或相似，如两性电离、等电点、紫外吸收性质和呈色反应等；也有一部分又不同于氨基酸，如高分子量、胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点。 蛋白质分离纯化意义 蛋白质和酶在生物体内催化代谢反应、物质运转、运动的 相互协调、兴奋的传导、生长与发育的控制等过程中都起重要的作用。因此，研究蛋白质对了解生命规律、指导工业生产、医药实践有着重大的理论与实践意义，而蛋白质的分离与纯化是蛋白质研究中必不可少的一个环节，必须要了解目的蛋白的分子量、等电点、溶解性及稳定性等基本性质才能制定由合理的分离纯化方法。 蛋白质的理化性质 蛋白质的两性解离 蛋白质的胶体性质 蛋白质的变性、沉淀和凝固 蛋白质的紫外吸收 蛋白质的呈色反应 }分离基础 }鉴别和检验 蛋白质的胶体性质 蛋白质在溶液中形成的颗粒直径大约1～100 nm，属于胶体颗粒的范围，所以蛋白质是胶体物质，蛋白质的水溶液是亲水胶体溶液。 蛋白质形成亲水胶体溶液的稳定因素：分子表面的水化层和电荷层。 蛋白质的水溶液是稳定的亲水胶体溶液。溶液扩散慢，粘度大，不能透过半透膜。 蛋白质的变性、沉淀和凝固 蛋白质的变性 蛋白质的沉淀：蛋白质分子凝聚而从溶液中析出的现象。蛋白质变性后，疏水侧链暴露在外，肽链相互缠绕，继而聚集，因而从溶液中析出，产生沉淀。变性的蛋白质易于沉淀；有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。 凝固是蛋白质变性后进一步发展的一种结果。 近20年，生物技术有了很大发展。但是，对于大多数生物技术产品来说，必需经过分离纯化，即所谓后处理过程，达到一定的质量标准后，才是可用产品。根据目前经验，大多数生物技术产品的研究开发中，约40-80%的资金用于后处理过程，而精细产品，基因工程产品比例更高。另外，分离纯化技术不仅影响产品质量，在一定程度上也影响着产量。分离纯化技术已成为生物技术领域中的关键技术之一。利用遗传工程的方法对目的产物，主要是蛋白质的组成予以改变或对某些部分加以修饰，使某些性质改变，使之有利于分离纯化如利用遗传工程的方法，将凝聚因子引入，使细胞在培养过程中凝聚，以便容易进行细胞分离 前景 前景 蛋白质的分离与纯化方法简介 PART 2 化1003 韩东升 蛋白质的分离与纯化 （一） 蛋白质的理化性质 （二） 分离纯化蛋白质的方法 蛋白质的分离纯化方法 一、离心法 二、沉淀法 三、透析法 四、过滤法 五、层析法 六、电泳法 蛋白质的分离纯化方法 离心法 借助离心力场，根据分子不同的大小、形状和质量在离心场中表现出不同的行为而达到相互分离的目的。 沉淀法基本原理：根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的。溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关。主要方法： 1. 等电点沉淀法2. 盐析沉淀法3. 有机溶剂沉淀法4. 蛋白质沉淀剂 蛋白质的分离纯化方法 透析法大分子的蛋白质不能通过半透膜而滞留在透析袋内；小分子的物质可以自由进出透析袋，直到它在透析袋内外的浓度相同，即达到平衡，而使大分子与小分子分开。 过滤法利用不同孔径的介质，截留一定大小的颗粒。 层析法以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质 电泳法 离心法 离心法 + = 返回 沉淀法 返回 透析法 返回 过滤法 返回 层析法 返回 电泳法 BACK Welcome…… PART 3 NOW Part 3：SDS电泳 化1003班 宋昊东 何为SDS电泳法？？ ？ sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠 polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳　 作用：用于分离蛋白质和寡核苷酸。 原理： 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶 、SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS） 非变性聚丙烯酰胺凝胶：电泳过程中，蛋白质保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。 SDS：仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初于建立1967年，在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。 过程详解 SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，能断裂分子内和分子间氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而