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第三章 质粒载体;第一节 质粒载体的概况; 一、质粒的定义、命名、分类、分布; 1、根据质粒的性状特征分为： 1）F质粒：又叫F因子或性质粒(sexplasmid)。 2）R质粒：通称抗药性因子。编码有一种或数种抗菌 素抗性基因。 3）Co1质粒 ：产生大肠杆菌素因子。编码有控制大肠 杆菌素合成的基因。;2、根据质粒的传递性 3、根据质粒的拷贝数 4、根据质粒和细菌的关系 5、质粒分布、大小和数目;二、质粒的基本特性;大肠杆菌质粒分子的结构示意图;2、质粒DNA分子的三种构型;环形双链DNA质粒分子的三种构型;不同质粒DNA分子量差异显著，最小的仅能编码2－3种蛋白质，分子量约为106 ，最大的可达108。 基因克隆载体的质粒DNA分子，必定包括三种共同的组成部分，即复制基因、选择性记号和克隆位点。;3、质粒DNA编码的表型;4、质粒DAN的复制类型;质粒DNA拷贝数的控制;;5、质粒的不亲和性;;;6、质粒的其他特性;第二节 质粒DNA的分离与纯化;质粒作为基因克隆的载体分子，一个重要的条件是获得批量的纯化的质粒DNA分子。因而寄主细胞的裂解作用是分离质粒DNA的关键步骤。 通常的裂解是加入溶菌酶或SDS使大肠杆菌细胞裂解。 理想的状况是，使每个细胞都充分破裂到能使质粒DNA顺利溢出，而又没有污染过多的染色体DNA。;1、氯化铯密度梯度离心法;优点：可获得高纯度、高质量的质粒DNA。 缺点：操作复杂； 价格昂贵（氯化铯）； 设备要求高（超速离心机）； 易造成环境污染和人员伤害（溴化乙锭是一 种极强的诱变剂）;原理：是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异发展出来的。 加热或PH介于12.0-12.5的范围内，线性DNA会被变性，两条链会完全分开。而超螺旋DNA由于双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补的两条链仍会紧密结合在一起，不会被变性。 致冷或恢复中性PH值，变性处理的质粒和染色体DNA混合物便会迅速复性。共价闭合环状的质粒DAN，由于两条链在形体上仍保持在一起，复性迅速准确。随机断裂产生的线性的染色体DNA分子，互补链彼此已分开，复性就不会那么迅速而准确，它们聚集形成网状结构，通过离心会与变性的蛋白质及RNA沉淀下来。滞留在上清液中的质粒DAN则可通过乙醇沉淀法收集。 ;分离纯化质粒DNA的程序;3、微量碱变性法提取质粒DNA步骤;4、影响质粒DNA产量的因素;1）寄主菌株的遗传背景;2）质粒的拷贝数及分子大小;;第三节 质粒载体的构建;一、天然质粒用作克隆载体的局限性;二、质粒载体必须具备的基本条件;;;三、质粒载体的选择记号;;;四、不同类型的质粒载体;1、高拷贝数的质粒载体;2、低拷贝数的质粒载体;3、失控的质粒载体;4、插入失活型的质粒载体;5、正选择的质粒载体;;;6、表达型的质粒载体;复制基因 选择性标记 多克隆位点 ;;第四节 重要的质粒载体;1、pSCl01质粒载体 ;;pSCl01质粒作载体克隆非洲爪赡的基因;2、CoLEl质粒载体;; 3、pBR322质粒载体;pBR322质粒载体的结构来源;pBR322质粒载体的形体图;pBR322质粒载体tet?基因的插入失活效应;4、pUC质粒载体;pUCl8及PUCl9质粒载体的形体图;(2)pUC质粒载体的优点 具有更小的分子量和更高的拷贝数 适用于组织化学方法检测重组体 具有多克隆位点MCS区段 ;5、能在体外转录克隆基因的质粒载体;pSP64质粒载体的形体图;6、穿梭质粒载体;二、酵母菌质粒载体;大肠杆菌—酿酒酵母穿梭质粒载体;;第六节 质粒载体的稳定性问题;随机分配的分子机理 (1)控制环路使质粒拷贝数的限制在最低的水平 (2)位点特异的重组作用消除质粒的寡聚体 (3)调节细胞的分裂活动阻止无质粒细胞的产生 (4)大肠杆菌素的合成增进了质粒的稳定性 主动分配的分子机理 (1)分配区的结构与功能 (2)预配对模型 (3)二聚体的解离有助于质粒的主动分配 (4)寄主致死功能对质粒稳定性的效应 ; 1、质粒载体不稳定性的类型;2、影响质粒载体稳定性的主要因素;在细胞分裂过程中质粒的分配方式;;; 3、随机分配的分子机理;;4、主动分配的分子机理;;;R1质粒parB体系对分裂后细胞的致死效应