重组子的筛选以及鉴定.pptx

NJU 重组子的筛选（screening）与鉴定第一节、有关概念转化子重组子期望重组子筛选鉴定转化子与非转化子转化子：接纳有外源DNA分子（载体或重组分子）的受体细胞。非转化子：未接纳外源DNA分子的非转化细胞。重组子与非重组子重组子：含有重组DNA分子的转化子。非重组子：仅含有空载体分子的转化子。期望重组子与非期望重组子期望重组子：含有外源目的基因的重组子。非期望重组子：携带非目的基因的重组子。转化子、重组子、期望重组子关系转化子重组子期望重组子筛选（screening）一般指从反应体系细胞群中辨别挑选出转化子或重组子的过程。反应体系细胞的组成：1、不含外源DNA的受体细胞2、含空载体的细胞（酶切未切开或重新环化的载体转化的细胞）3、重组子：（1）含目的重组DNA的细胞（2）含非目的重组DNA的细胞鉴定对筛选出的重组子DNA进行进一步酶切、测序等，鉴定是否为目的重组子及重组子DNA序列的正确性等。报告基因（reporter gene）指载体上携带的、表达产物容易被检测且能够指示外源基因导入受体细胞与否及表达水平的基因。构建载体时，一般将报告基因与目的基因融合，并将报告基因置于目的基因启动子控制之下，报告基因与目的基因同步转化与表达。第二节、大肠杆菌重组体的筛选一、质粒载体转化大肠杆菌细胞的筛选（一）抗生素平板结合插入失活筛选法—根据标记基因是否失活，确定是否有外源基因插入。插入失活筛选法的应用两种情况：双抗生素抗性基因标记载体含一个抗生素抗性标记，一个lacZ′基因的载体带双抗生素抗性标记的质粒载体转化大肠杆菌的筛选方法载体携带两个抗生素抗性基因，外源基因插入其中一个基因内导致其失活，用两种抗生素平板筛选重组子。第一步：正选择。在不进行插入失活抗性基因的相应抗生素平板上转化子可以生长，非转化子不能生长，可将转化子直接从平板上挑出来；第二步：负选择。在插入失活抗性基因的相应抗生素平板上转化子中的非重组子（未插入外源基因）可以生长，重组子（插入外源基因）不能生长，应与第一种抗生素板进行对照并在其上挑出含重组子的菌落。例如pBR322质粒含有TC r、Amp r两个抗药性基因，外源基因插入失活TC r后，会有三种不同表现的细胞:未转化的受体细胞— TC sAmp s含载体的转化菌落－ Ampr Tcr 含重组体的阳性菌落—Ampr Tcs空载体转化菌落及重组载体转化菌落空载体转化菌落筛选具体做法1、用转化反应液涂布含氨苄的LB平板，长出转化子—Ampr ；2、用无菌牙签将Ampr的转化子逐一挑在Tc平板上（或用无菌丝绒布、无菌滤纸影印），比较两块板上的菌落生长情况，从Amp板上挑选出Tc板上不长的菌落即为重组子。 注意：氨苄平板菌落密度不宜过大影印平板培养法利用lacZ′基因的插入失活筛选重组子—蓝白筛选法 载体同时含氨苄青霉素抗性基因和lacZ ′基因，外源基因插在lacZ′基因内，受体细胞为lacZ ′基因互补菌。在同时含氨苄青霉素和蓝白筛选显色剂（ X-gal）的平板上筛选： 未转化细胞不能生长； 空载体转化菌长成蓝色菌落； 重组子长成白色菌落。例：pUC质粒系列、pGEM质粒系列、M13噬菌体lacZ基因编码β-半乳糖苷酶； lacZ′基因编码β-半乳糖苷酶的N端序列α片段 ，互补菌染色体上携带的缺陷基因编码C端片断，两者互补（α-互补）形成有功能的全酶。蓝白筛选菌落生长照片X-gal5-Bromo-4-Chloro -3-Indoly- ?-D-Galactoside)，5-溴-4-氯-3-吲哚-?-D-半乳糖苷?-半乳糖苷酶显色剂：生色底物IPTG及其作用IPTG：即Isopropyl- ? -D-thioagalactoside，异丙基- ?-D-硫代半乳糖苷作用：乳糖操纵子诱导物，和载体上携带的大肠杆菌乳糖操纵子的调节基因（Lac I ）编码产物—阻遏蛋白结合，阻止其与操纵基因结合，使操纵子控制的基因（lacZ等）得以表达。含Lac I 的载体：如pUC8，需要诱导物不含Lac I 的载体：如pUC18/19，不需诱导物研究中通常为何用IPTG而非乳糖作诱导物？乳糖会被宿主细胞利用而IPTG不被利用。大肠杆菌乳糖操纵子基因组成IPTG例1:pUC8中lacZ′基因的插入失活例二：pGEM-3Z中lacZ′基因的插入失活（二）插入表达筛选载体的选择标记基因前连接一段负调控序列，插入失活负调控序列后，其下游的筛选标记基因才能表达。如pTR262质粒，在Tc（Tet）基因前有来自噬菌体的cI基因，可编码cI阻遏蛋白，抑制Tet表达。cI基因（ HindⅢ或BglⅠ位点）插入失活，Tc基因表达，受体细胞在Tc板上生长；未转化细胞及及空载体转化细胞Tc表达被抑制，在Tc平板上不生长。二、 重组噬菌体DNA转入大肠杆菌后重组