外周血循环DNA作为生物标志物在卵巢癌临床中的应用研究试验方案.DOCVIP

外周血循环DNA作为生物标志物在卵巢癌临床中的应用研究试验方案 试验目的：外周血循环游离DNA作为生物标志物在卵巢癌临床应用的价值 试验类别：诊断试验 申办单位：苏州大学 研究单位：苏州大学附属第二医院 试验负责人：李凯 主要研究者：张荣 试验日期：2012年11至2017年11月 联系人：张荣 电话：0512一、临床试验背景 卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，卵巢癌的死亡率居妇科肿瘤首位。70% 的患者发现时已是晚期( Ⅲ期和Ⅳ期)，虽经积极治疗，5 年生存率也仅为15%~20%，若早期(Ⅰ期) 发现，5 年生存率可达77% ~87%，若为分化良好的Ⅰ期患者，5 年生存率可达到94%[1]。因此，提高生存率的关键是早期诊断。特异而敏感的肿瘤标记物在辅助诊断卵巢癌中起重要作用。 近年来检测肿瘤患者外周血中游离DNA 的改变为肿瘤的早期诊断和复发监控提供了一种新的手段。游离DNA可存在于血浆或血清、脑脊液及滑膜液等体液中，是指一种游离于细胞之外的DNA，其中血液中的相应成分又称循环游离DNA或循环DNA。早在1947年Mandel等[2]就发现了人的血液循环中存在游离DNA。自1977 年leon等[3]发现肿瘤患者的血浆DNA 含量明显高于正常人后，关于肿瘤患者血中游离DNA的研究逐渐成为人们关注的热点。对游离DNA的定性研究显示, 肿瘤患者的血浆DNA 具有与肿瘤细胞DNA一致的基因异常[4-7]。 通过研究发现，原癌基因的突变，抑癌基因甲基化改变和微卫星不稳定性改变[8-9]，可以预测肿瘤患者的预后[10]。目前国外对血中游离DNA的研究多集中在肺癌、直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤等西方国家的“多发病”上，对卵巢癌的研究不多。Hagiwara等[11]对肺癌吸烟与不吸烟患者及健康人的游离DNA 分别进行了p53基因编码子248和249的突变检测，认为吸烟者游离DNA中p53基因突变可作为癌症的预测指标。Ryan等[12]对大量结肠癌患者的游离DNA研究表明，游离DNA中k-ras 基因突变的患者肿瘤复发率可达62. 5%。欧洲癌症和营养学前瞻性队列研究收集了准健康者至其癌症发生后的游离DNA，进行了k-ras基因12位编码子和p53基因的突变检测，这一系列研究包括膀胱癌、肺癌、上消化道癌等，研究发现在肿瘤得到临床诊断前18. 3个月，在血中游离DNA中就可检测到相应的基因突变，这种可预测性与肿瘤原发部位、类型和分期相关。 Frattini等[13]表明，游离DNA 定量、定性及定点的联合检测将提高肿瘤的临床诊断率。该研究观察了大肠癌患者手术前后的游离DNA 水平和游离DNA中k-ras和p16 的变化，发现术后游离DNA 水平逐渐下降，当肿瘤复发时快速升高，并重新可以检测到突变的k-ras和p16基因的甲基化。Melnikov[14]等用甲基化特异性PCR检测了卵巢癌患者手术的肿瘤组织和血浆中的甲基化差异，发现将BRCA1、HIC1、PAX5、PGR、THBS1基因合并检测，诊断卵巢癌的敏感性为85%，特异性为61%，其效率与直接应用肿瘤组织相当。Dobrzycka[15]等用PCR-RFLP的方法评价了血浆游离DNA与卵巢癌进展的关系，发现游离DNA的增加与肿瘤生存率降低有关。根据以上研究结果，我们希望可以通过类似的研究，发现卵巢癌患者游离DNA水平和相关基因的改变，获取相关中国人群血中游离DNA与卵巢癌病理变化的关系，为卵巢癌防治提供参考，并通过量化相关指标，提供可供复发监控的基因诊断方法。 目前研究充分表明了游离DNA 的变化与卵巢癌的关系密切。游离DNA 的发现及研究为疾病的非创伤性诊断、监测提供了可能，解决了肿瘤基因检测只能用肿瘤组织的标本限制，为肿瘤的诊断、治疗监控、预后随访等研究提供了简便途径。但是，由于游离DNA的微量存在，使得目前DNA 的提取比较困难，提取试剂昂贵。游离DNA 的检测方法不一，各自敏感度差异较大，游离DNA 检测的特异性低。因此，为方便游离DNA 的临床使用，需要建立实用性较强的检测方法。 本试验拟利用高保真DNA聚合酶的作用下巢式PCR和甲基化特异性的荧光定量PCR 检测游离血中游离DNA浓度，比较卵巢癌患者、卵巢良性囊肿患者、健康女性中血浆游离DNA 浓度的差别，并检测血中和卵巢癌手术标本中热点基因甲基化状态，以期发现外周血DNA的与卵巢癌组织的相关性。展望未来，卵巢癌游离DNA 的基础及临床研究必将成为受人瞩目的研究热点。 二、试验目的 评价血浆游离DNA作为生物标志物在卵巢癌诊断及预后方面的意义。 三、试验设计 本试验为回顾性队列研究。 四、受试者的选择和退出 1.入组标准： 年龄：20-80岁。 性别：女。 1）卵巢癌组： 具有病理学诊断依据的新发卵巢癌