(动物传染病学实验课件)6 伪狂犬病抗体检测[精品].ppt

实验六、伪狂犬病抗体检测（阻断ELISA) 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) 将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，从而使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在。 * 一、实验目的 掌握ELISA的原理和类型。 掌握阻断ELISA操作程序和结果判定的方法。 * 二、实验原理 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性； 抗原或抗体可通过共价键与酶形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； 酶结合物催化底物发生化学反应，根据颜色的有无和深浅判定抗原抗体反应的发生与否。 * 间接法（Indirect ELISA） 阻断法（Block ELISA) 双抗体夹心法（Sandwich ELISA) 竞争法（Competitive ELISA) * （1）间接法测定抗体 A. 将抗原吸附于固相载体表面； B. 加抗体, 形成抗原-抗体复合物; C.?加酶标抗体； D. 加底物。测定底物的降解量＝抗体量。 * 显色 间接ELISA * （2）阻断法测定抗体 A.?将抗原吸附在固相载体表面; B. 先加待检血清（抗体）, 形成抗原-抗体复合物; C.?再加酶标单抗(二抗)； D. 加底物。 * 酶标单抗 血清？ 底物显色 阻断ELISA * （3）双抗体夹心法测定抗原 A. 将抗体吸附于固相表面; B. 加待检抗原，形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体; E. 加底物。底物的降解量＝抗原量。 * （4）竞争法测定抗原 A. 抗体吸附在固相载体表面; B. 同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。 * 酶标板，酶标仪 包被缓冲液：0.025M pH9.6碳酸盐缓冲液 猪伪狂犬病毒（PRV） —— 抗原 样品稀释液： pH7.4 PBS 三、实验材料 * 阴性对照（EP管中，已稀释） 阳性对照（EP管中，已稀释） 样品 —— 待测猪血清（EP管中，已稀释） 碱性磷酸酶标记猪PRV单抗—— 酶标单抗（EP管中，已稀释） 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS（青瓶） * 常用酶及底物 常用酶 底物 反应后颜色 辣根过氧化物酶（HRP） 邻苯二胺（OPD） 棕黄色 碱性磷酸酶 （AP） 四甲基联苯胺 （TMB） 蓝色 * 底物缓冲液： pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液 底物溶液：TMB（四甲基联苯胺），底物缓冲液，30% H2O2，新鲜配制 终止液 * 1.抗原处理： 2.抗原包被： 取酶标板，加入100μL/孔的抗原稀释液 4℃，18h 取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体 以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次 四、实验方法 * 3.加待测血清： 标记各孔，加入相应液体100μL/孔 1 2 3 4 阴性 待测 阳性 待测 4.加单抗： 37℃，30min 甩干孔内液体 以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次 各孔加入酶标单抗100μL/孔 37℃，30min 5.显色： 甩干孔内液体 以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次 加入底物溶液100μL/孔 避光显色，10min,加终止液1滴 6.观察结果 * 取稀释好的被检血清2份和阴、阳性对照血清，每孔加入100μl，置37℃温育30分钟。 洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200μl，静置3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复3次。 每孔加酶标单抗100μl，置37℃温育30分钟。 洗板：同步骤2。 显色与终止：每孔先加底物A液、再B液各1滴(50μl)，混匀，室温（18-25 ℃）避光显色10分钟后。 终止：每孔加终止液1滴(50μl) （0.25% 氢氟酸），终止反应。 10分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标仪测定OD值。 结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD630值与阳性对照孔平均OD630值之差≥0.4。 S=样品孔OD630值，N=阴性对照孔OD630值 如果S/N比值≤0.6，样品判定为PRV抗体阳性; 如果S/N比值≤0.7但 0.6，样品可疑; 如果S/N比值 0.7，样品判定为PRV抗体阴性。 * 五、结果与分析 阴阳性对照样品的OD630 ＝? S/N＝?，被检血清是阴/阳性？ 结果与预期的不符，可能的原因是什么？ * 预期结果 阳性：无色 阴性：蓝色 1 2 3 4 阳性 阳性 阴性 被检 血清？ 底物显色 被检 ？ ？ * ELISA前血清样