氨基酸的分离鉴定.pptVIP

实验4 氨基酸的分离鉴定　　　　　　 －纸层析法 层析法（色谱法） 是一种物理的分离方法。固定相与流动相。 吸附层析、离子交换层析、薄层层析、凝胶层析（凝胶过滤）、亲和层析、分配层析。 分配层析 分配系数：当把一种物质在两种不混溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀的分配。达到平衡时，这种物质在两种溶剂中的浓度之比是一个常数。 是一种连续抽提法。一种溶剂通常是被结合在固定的 　惰性支持物（柱、膜、纸）上的水，另外一相由流动的被水饱和的有机溶剂构成，它流过固定相。 如果某一混全物的各组分在这两相中的分配系数有足够的差异，它们就可以被分离。 一、实验目的 1.通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法 2. 掌握氨基酸纸上层层析法的操作技术（点样、平衡、展层、显色、鉴定） . 二、实验原理 1.是分配层析的一种。在纸上水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上溶质就在水相和有机相之间进行分配，溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。 2.氨基酸与茚三酮的显色反应。 3.物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值来表示的。在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。 Rf＝ 4. Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、PH层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。 5.上层层析、下层层析、单向层析、双向层析。 三、仪器、材料和试剂 实验仪器 1．层析缸、培养皿、小烧杯、长颈漏斗 2．毛细管、吹风机、电热鼓风干燥箱 3．层析滤纸、手套 、透明胶带或针线 实验材料和试剂 1．氨基酸溶液　分别配制0.5%的Lys、Alu、Ile、Met溶液及它们的混合液（各组份浓度均为0.5%）。 2．显色剂　0.1%水合茚三酮丙酮溶液。 3．扩展剂（展层剂） 　酸溶剂系统：正丁醇:80%甲酸:水＝15:3:2（体积比），平衡溶剂与扩展剂相同。每组配制30ml 　碱溶剂系统：正丁醇:12%氨水:95%乙醇＝13:3:3（体积比），平衡溶剂为12%氨水。 四、操作步骤与方法 1．将盛有扩展剂10ml的小烧杯和培养皿置于密闭的层析缸中。 2．戴手套取层析滤纸一张作标记。 3。点样：干后重复点一次，直径最大不超过3mm。缝成筒状，两边不能接触。点样面朝外，点样端朝下，盖上层析缸盖，平衡约20~30分钟。 4.展层　用长颈漏斗，扩展剂的液面需低于点样线1cm。上沿约1厘米时，取出滤纸，用铅笔标出溶剂前沿界线，干燥。 5．显色　用0.1%茚三酮丙酮溶液均匀浸透，烘箱（65℃）5分钟或用热风吹干。脯氨酸、羟脯氨酸产生黄色物质外，所有α－氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮产生兰紫色物质。 五、实验结果与讨论　　 六、注意事项 1、切勿用手直接接触滤纸和显色剂。 2、点样过程中必须在第一滴样品干后再　　点第二滴。 3、使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。 七、思考题 1、何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？ 2、层析缸中平衡溶剂的作用是什么？ 3、滤纸为什么要在层析缸中预先悬空密封饱和30min？ 4、展开时为什么要调节滤纸使溶剂前沿线平行于点样线？ 5、实验结果为什么有时会产生拖尾、相邻氨基酸分不开等异常现象？ * * α＝ 物质在溶剂II中的浓度 物质在溶剂I中的浓度 原点到溶剂前沿的距离 原点到层析点中心的距离 溶剂前沿 层析点 原点 溶剂前沿 亮 苯丙 缬 脯 赖