双向电泳操作步骤及相关溶液配置.docVIP

双向电泳操作步骤及相关溶液配置 一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。 二、实验步骤： 1. 样品的溶解 取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液（1mg蛋白：100ul裂解液）振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。其中每隔10~15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，-80℃保存。 2. Bradford法测蛋白含量 取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解，测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。 取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul，5ul，10ul，15ul，20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为80ul），然后，各管中分别加入4ml的Bradford液（原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。（测量过程要在一个小时内完成）。 3. 双向电泳第一向——IEF（双向电泳中一律使用超纯水） 3.1 水化液的制备 称取2.0mg 的DTT，用700ul水化