2012年实验方案12065.docVIP

干旱胁迫下三种杨树嫩茎质外体空间的激素、离子、叶绿素荧光参数和气体交换参数动态变化微透析分析实验方案 1激素分析 1.1材料与设备 1.1.1供试材料 （1）苗木扦插培育（略） （2）实验材料干旱胁迫处理 实验材料处理方式为:选取状态良好且长势相同的杨树盆栽苗，分为三个组每组设三个重复。第一组为对照组，处理方式为每三天浇一次透水（每次浇水量以花盆底部见水为准）；第二组为中度水分胁迫实验组，浇水量为浇透水用水量的1/10；第三组为重度水分胁迫实验组，处理方式为第一天浇透水以后不再浇水。每个组均设三个重复。三种杨树水分胁迫处理方式都相同。分别在水分处理后第2、4、6、8、10、12、14、16天和复水后第二天从不同水分胁迫处理的杨树嫩茎上部进行微透析取样分析，直到重度胁迫叶片大部分掉落后复水。本试验重复3次。每天晚上5-6点采用称重法测量土壤含水量。 1.1.2实验设备、试剂（略） 1.2实验方法 1.2.1取样方法 取样方法 本实验选用美国BAsl公司的微透析仪(BAsi2701)，包括微注射泵、微透析探针（MD一2200)、进液管和出液管。探针截留分子量为30KD，管内灌流液为Mllipore一Q超纯水。探针入口连接微透析泵，出口连接微透析收集器。取样时，先连接好电源、微量注射泵、注射器、进液管、探针和出液管，开动微量注射泵，调整泵的灌流速度为1ul/min;当出液管头开始出水时，为防止微透析探针的损坏，先将硬的导引管成30一45度角插入距杨树顶端15cm左右（从上往下数3-4片成形叶处）的嫩茎部位，然后再植入探针，同时开始计时。在探针插入120min达到稳定状态后将导出管放入500ul离心管中开始定时收集透析液。为防止灌流液流失，在插入探针后立即采用牙托水(取少量自凝粉，用胶头吸管吸适量义齿基托树脂液剂搅拌，至勃糊状即可)密封探针边缘。取样的离心管放在冰盒里，收集完样液后放到四度冰箱备用，但时间不能太长，不能超过一天。 体外回收率的测定 在微透析取样前后分别把微透析探针插入配置的标准溶液中，稳定后收集透析液，用高效液相色谱仪分析其含量。最后利用HPLC测定取样前后透析液中各激素浓度与标准液中各激素浓度之比，也就是该探针的体外回收率。 1.2.2激素分析方法 （1）色谱条件 Inertsil005一SP(5um，250mm×4.6mm)色谱柱，流动相为:色谱甲醇和超纯水(含0.2%纯磷酸)，体积之比为60:40，柱温300C，流速0.6mL/min，检测波长210nm，进样量20ul;岛津Lc-20AB高效液相色谱仪。收集到的透析液在该色谱条件下直接进样。 （2）标准溶液的配置 在BioBasicInc公司购买的CA3、ABA、6-BA、IAA的标准品，准确称取标准品各5mg，置于50ml容量瓶内，用流动相定容至50mL，配制成100ug/mL的标准母液，备用。然后用母液稀释为各个激素所需配置的最终浓度，以浓度为横坐标，吸收峰面积为纵坐标，得到四种激素浓度与峰面积之间的回归方程及标准曲线。 生长状况观察 分别在处理后的第记录苗木生长情况,包括叶片的颜色、、脱落情况Na+、K+和Na+、K+和 （2）Na+、K+和Ca2+浓度的测定 将嫩茎透析液用超纯水分别稀释10倍后，采用原子吸收分光光度计（日立Z-2000）石墨法分别测定Na+、K+和 Ca2+浓度，将测定的浓度用体外相对回收率进行修正。 用Li-6400便携式光合仪（Li-COR，USA）的荧光叶室测定 Ci C0 表3续表 时间 第10天 第15天 实验组 1组 2组 3组 备注 1组 2组 3组 备注 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 实验数据 荧光参数和 气体交换参数 Fo Fm Fv/Fm ETR Pn Gs Tr Ci C0 时间 复水后第2天 实验组 1组 2组 3组 备注 1组 2组 3组 备注 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 实验数据 荧光参数和 气体交换参数 Fo Fm