基因工程大-内蒙古大学.pptVIP

基因工程大实验 一、实 验 目 的 学习基因操作的基本技术 熟悉基因克隆常规仪器的使用 学习科研项目的开题论证 培养科学实验的独立操作能力 建立做好原始实验记录的习惯 练习撰写研究论文 二、教 学 组 织 学生自主设计方案 教师审查方案可行 学生独立实验操作 教师现场巡回指导 学生失败互相救助 教师把关实验结果 三、实 验 内 容 1. 目 的 基 因 纳豆激酶成熟肽（NK） （原核） 位于pMD18-T-NK(full) 绿色荧光蛋白（EGFP） （真核） 位于pEGFP-N1上 红色荧光蛋白（DsRed2）（真核） 位于pDsRed2-1上 其它基因（教师在研课题） 2. 载 体 pMD19-T （TA克隆） pUCm-T （TA克隆） pET-Trx （融合表达） pGEX-4T1 （融合表达） pMD18/19-T pUCm-T PGEX-4T1 四、 实 验 流 程 参考计划 实验一 质粒DNA的小量制备 实验二 质粒DNA电泳鉴定 实验三 质粒DNA的酶切 实验四 PCR扩增制备目的基因 2. PCR仪的循环程序设置： 3. PCR产物电泳 实验五 从琼脂糖凝胶中回收DNA片断 实验六 目的基因片段与载体连接 实验七 感受态菌的制备 实验八 细菌转化 实验九 转化克隆的筛选和鉴定 电泳鉴定结果 实验十 外源基因的诱导表达 实验十一 SDS检测表达蛋白 * * 邢万金 苏慧敏 内蒙古大学生命科学学院生物系 目的基因的亚克隆、表达载体的构建、在大肠杆菌中诱导表达。 pMD18-T-NK(full): 3.8kp 纳豆激酶全长1181bpDNA已插入pMD18-T 克隆载体： 表达载体： pET-Trx 3.3kb MCS Amp T7 PT7 RBS TRX(his-patch) CTC GAA GTT CTG TTT CAG GGT CCA GCA GGA TCC GCA GAA TTC AGC GCT AGC TAA CAT CAT CAT CAT CAT TAA GCTT Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro BamHI EcoRI NheI HindIII BamHI EcoRI NheI stop HindIII P3C cut site 提取目的基因模板 提取表达载体质粒 PCR扩增目的基因 EcoRI+BamHI双酶切回收 T载体 目的基因亚克隆载体 EcoRI+BamHI双酶切回收 目的基因片段 目的基因表达载体 IPTG诱导表达 酶 切鉴定 酶 切鉴定 SDS检测 感受态DH5α 感受态BL21(DE3) 观察，转入清水，照相 下午 灌胶加样电泳，染色45min，脱色过夜 上午 第九天 OD600=0.5时诱导表达3h， 离心集菌 下午 早晨7：00摇菌[包括空BL21（DE3）]，练习组装SDS电泳模具 上午 第八天 讲解实验论文写作要求 下午 提重组表达载体质粒，酶切验证，转化BL21(DE3)，涂平板过夜 上午 第七天 挑重组表达载体转化克隆，摇菌过夜 下午 作感受态BL21(DE3) 上午 第六天 摇BL21(DE3) 下午 “目的基因-表达载体”连接液转化DH5a，涂平板过夜 上午 第五天 回收目的基因片段，与表达载体连接过夜 下午 提重组T载体，EcoRI和BamHI双酶切验证 上午 第四天 挑重组T载体平板克隆，摇菌过夜 下午 上午 第三天 “目的基因-T载体”连接液转化涂板，回收pET-Trx， 下午 作感受态DH5a，EcoRI和BamHI双酶切并回收表达载体 上午 第二天 PCR扩增目的基因，然后与克隆载体连接过夜，倒平板，摇DH5a 下午 提质粒（表达载体和目的基因模板质粒） 上午 第一天 讲解仪器，发放移液器等，摇菌管和培养皿灭菌，摇表达载体和目的基因菌 第零天下午 （1）提取目的基因载体（作PCR模板） pMD18-T-NK(full) pEGFP-N1 pDsRed2-1 （2）提取表达载体pET-Trx（备酶切） pET-Trx pGEX-4T1 37℃ dd water