豌豆早期结瘤素基因PsSym10的克隆及其与结瘤相关基因.docVIP

豌豆早期结瘤素基因PsSYM10的克隆及其表达载体的构建 谢玉会，田婷婷，周小全，曲淑娟，黄国栋，苏承刚，张兴国* （西南大学园艺园林学院，重庆400715） 摘要：采用PrimStar HS DNA聚合酶从豌豆基因组DNA中扩增出了豌豆早期结瘤素基因PsSYM10。序列分析表明，基因GenBank公布的PsSYM10基因与结瘤相关基因PsENOD12、凝集素基因PsLectin串联组合，构建成了双元表达载体。 关键词：豌豆；早期结瘤素基因PsSYM10；PsENOD12A；凝集素基因PsLectin；双元表达载体 根瘤菌与豆科植物能形成一种特殊的共生体---根瘤。根瘤的形成是根瘤菌与宿主豆科植物之间分子对话的产物，这个过程涉及到两者之间复杂的信号识别、基因表达调控、营养物质的交换等。植物凝集素在其中起着至关重要的作用[1]，转豌豆凝集素基因psl的三叶草能够识别原不能识别的豌豆根瘤菌，并获得结瘤固氮功能[2]。早期结瘤素是在根瘤固氮之前参与根瘤菌与根毛相互作用及根瘤形态发生过程的植物多肽或蛋白，在细菌与植物间的信息传递、根瘤菌的侵染、侵入线的形成、根瘤的发生与构建中发挥着重要作用[3]。豌豆PsENOD12在根皮层细胞分裂形成根瘤原基时得到特异性表达，其家族基因PsENOD12A的表达与侵入线的形成紧密相联[]。PsENOD12A、凝集素基因PsLectin串联组合构建双元表达载体，为进一步研究结瘤相关基因的信号传递、表达调控以及转PsSYM10、psl和PsENOD12A基因的非豆科植物与豌豆根瘤菌的相互作用奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 所用豌豆材料为食荚大菜豌(Pisum sativum L.cv. Shijiadacaiwan)。大肠杆菌菌株DH5α、根癌农杆菌菌株EHA105等由本实验室繁殖和保存。大肠杆菌及农杆菌感受态细胞由本实验室制备。带有豌豆凝集素基因PsLectin和PsENOD12A基因的双元表达载体pVCT2120由本实验室构建并提供。pEASY-T3载体购自重庆卓诺生物技术有限公司。 1.2 PsSYM10基因的克隆 参照GenBank中公布的豌豆基因（AJ575250）序列[]，分别在其启动子和终止子设计PCR引物，P序列为’-GGTCAAGTGCTAGAAATCATCTTGG-3’、P2序列为’-GCTGACTTGCATCAACATTTTATGGG-3’。作为模板，采用PrimStar HS DNA 聚合酶（TaKaRa Co.，Japan）进行PCR扩增。扩增条件为98℃ 1 min，1个循环；98℃ 10 sec，℃ 15 sec，72℃ min 25 sec，2个循环；72℃最后延伸10 min。PCR1％Taq DNA 聚合酶加“A”尾，TA克隆到pEASY-T3载体，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。待菌落PCR筛选阳性克隆(pT3-PsSYM10)后委托上海生工生物技术有限公司测序。 1.3 多基因串联组合双元表达载体的构建 用限制性内切酶Sal I酶切pT3-PsSYM10质粒DNA，经Klenow Fragment酶补平，再用Nco I酶切，回收大片段；同时用Ecl136 Ⅱ和Nco I酶切pVCT2120质粒DNA，回收大片段。经T4 DNA连接酶过夜连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经PCR扩增检测和酶切鉴定获得多基因串联组合的双元表达载体pVCT2121。其中质粒的提取、酶切、连接及转化参照文献[10]进行。 1.4 转化根癌农杆菌 采用冻融法将双元表达载体pVCT2121转入根癌农杆菌菌株EHA105中，并经PCR扩增鉴定。 2 结果与分析 2.1 PsSYM10基因的克隆与序列分析 以豌豆gDNA为模板、P1/P2为引物，扩增出约3.3 kb的目的条带（图1-A）。克隆入pEASY-T3载体，PCR筛选阳性克隆（图1-B），获得重组质粒pT3-PsSYM10。测序结果显示PsSYM10全长3310 bp（GU292812），没有内含子，编码594个氨基酸残基，与GenBank中登记的、源自品种Alaska的同源基因（AJ575250）在碱基和氨基酸序列上的相似性分别为98.6%和99.7%（图1-C），其中，第370位的氨基酸发生突变，第393位的丝氨酸变成亮氨酸。 2.2 多基因串联组合双元表达载体的鉴定 pVCT2120和pT3-PsSYM10的酶切回收片段连接和转化后，从平板上随机挑选7个克隆，先用引物P1/P2对pVCT2121进行菌落PCR扩增，得到3310bp预期大小的阳性克隆有5个（图2-A），再用psl的上下游特异性引物p3/p4[11]和PsENOD12A的上下游特异性引物p5/p6[12]，其中，p3、p4、p5、p6序列分别为5’