第三章 基因工程制药推荐.ppt

3、工艺流程 工程菌构建 ↓ 发酵 ↓ 细胞破碎 ↓ 超滤 ↓工艺3 排阻色谱 ↓ 离子交换色谱 ↓ 超离心脱盐 ↓ 无菌过滤 ↓ Al(OH)3吸附 ↓ 分装 微滤 ↓ 硅胶吸附 ↓ 疏水色谱 ↓ 硫氰酸盐处理 表面活性剂提取 ↓ 沉淀、离心、超滤 ↓ 凝胶色谱 ↓ 离子交换色谱 ↓ 超滤 工艺2 工艺1 * 4、酵母重组乙肝疫苗的生物学活性评价 我国现行的是小蛋白疫苗，即S疫苗，其优点： S是HBsAg主要成分，其抗体有良好的中和作用。 S蛋白具有分泌性，利于产物的纯化。 S蛋白可形成颗粒，具有良好的免疫原性。 缺点： 5~10%的接种者弱反应或无反应。 至少需3针以上的免疫接种。 仅有预防作用而无治疗作用。 * 5、酵母重组乙肝疫苗质量标准 检测项目 检测方法 规定标准 原液检定 吸附完全性 硫氰酸盐含量 TritonX-100含量 酶联免疫法 紫外吸收法 紫外吸收法 吸附率≧95.0% ≦1.0ug/ml ≦15.0ug/ml 半成品检定 pH 游离甲醛含量 铝含量 硫柳汞含量 渗透压摩尔浓度 电位法 游离甲醛测定法 氢氧化铝测定法 硫柳汞测定法 渗透压摩尔浓度测定法 5.5~7.2 ≦20.0ug/ml 0.35~0.62mg/ml 30~70ug/ml 280±60mOsmol/L 成品检定 鉴别试验 外观 pH 铝含量 硫柳汞含量 体外相对效价测定 无菌试验 异常毒性试验 细菌内毒素检查 酶联免疫法 肉眼观察 电位法 氢氧化铝测定法 硫柳汞测定法 酶联免疫法 直接培养法或滤膜过滤法 小鼠试验和豚鼠试验 鲎试剂法 阳性 乳白色混悬液，可因沉淀分层，易摇散，不应有摇不散的块状物 5.5~7.2 0.35~0.62mg/ml 30~70ug/ml ≧0.5 无菌生长 全部动物健存，无明显异常反应 ≦10.0EU/ml * （三）基因工程生产人胰岛素 1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。 1987年，Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。 上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免疫原性、注射吸收迅速等优点。 * 基因工程人胰岛素生产工艺 （1）A链、B链分别表达法 （2）人胰岛素原表达法 （3）分泌型人胰岛素原表达法 * * * * * * * * 质量控制 鉴别胰岛素：反相HPLC法；肽谱图法 效价测定：反相HPLC法 融合蛋白中人胰岛素原检测：非放射性标记法 * 研究现状 类胰岛素开发 胰岛素分泌基因工程 * * 参考楼士林《基因工程》p258 2、纯度分析 目的蛋白质含量测定通常根据目的蛋白质的理化性质、生物学特性来进行测定。 采用的方法有4项检测：（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAEG）、（2）等电点电泳、（3）各种高效液相分析法（HPLC）、（4）毛细管电泳（CE）。 * 3、杂质检测 杂质分为2 种类型：蛋白质杂质、非蛋白质杂质。 （1）蛋白质杂质的主要来源 （2）非蛋白质杂质主要类别 （3）常见的杂质和污染物、以及检测方法 * （1）蛋白质杂质的主要来源 （A）残余的宿主细胞蛋白质， （B）目的蛋白质自身变性、由于蛋白酶引起的降解、由于冷冻脱盐导致的沉淀、由于冻干引起的聚合。 * （2）非蛋白质杂质主要类别 （A）杂菌污染，可通过微生物学方法来测定。 （B）热原质和内毒素，检测可用鲎试剂。 （C）宿主细胞所残余的DNA，一般认为DNA残余含量小于100pg/剂量，是安全的。基测定方法可采用核酸杂交法。 * （3）常见的杂质和污染物、以及检测方法 杂质和污染物 常用检测方法 1：内毒素 鲎试剂、家兔热原法 2：宿主细胞蛋白质 免疫分析、SDS、CE3：其它蛋白质杂质（如培养基） 免疫分析、SDS、HPLC、CE4：残余DNA NA杂交、紫外光谱、蛋白结合5：蛋白变异 肽谱、等电点聚焦（IEF）、HPLC、CE6：甲酰基甲硫氨酸 肽谱、IEF、HPLC、CE7：甲硫氨酸氧化 肽谱、氨基酸分析、质谱、Edman分析8：产物变性、聚合、脱氨基 凝胶分子筛、SDS、HPLC、CE9：单克隆抗体亲和配基脱落 免疫分析、SDS10：氨基酸取代 肽谱、氨基酸分析、质谱、Edman分析11：微生物污染物 微生物学检查12：支原体污染物 微生物学检查13：病毒污染物 微生物学检查 * 4、生物活性测定 （1）免疫测定法重组蛋白质是一种抗原