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第五章 高效液相色谱分析法 内容提要： 第一节 高效液相色谱法概述 一、高效液相色谱法及其特点 二、HPLC与GC的比较 三、HPLC的主要类型及其分离原理 一、高效液相色谱法及其特点 液相色谱法：以液体为流动相的色谱法。 经典液相色谱：早期的液相色谱。 高效液相色谱（High Pertormance Liquid Chromatography，HPLC）：特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。 高效液相色谱法的特点： 特点：高压、高效、高速、高灵敏度、高选择性， 是高沸点、热不稳定有机物及生化试样的高效分离分析方法。 高压：150-350*105 Pa 高效：分离效能高，柱效大于30000塔板/米 高速：分析速度快，由于使用高压输液泵，流动相流速大大加快。 高灵敏：检测灵敏度高。10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）。 高选择性：不仅可分离同分异构体，还可分析在性质上极为相似的旋光异构体。 二、HPLC与GC的比较 1、HPLC与GC的共同点 （1）它们都是以复杂混合物分离为目的的仪器分析方法。色谱分离操作和数据处理均可实现自动化，也都可与其他分析仪器如光谱、质谱等联用。 （2）二者的色谱分离理论是一致的，气相色谱中的分配平衡、塔板理论、速率理论等，均可应用于液相色谱，仪器结构和操作技术也十分相似。 （3）分析流程及定性、定量的原理和方法完全一样。液相色谱也是根据保留值定性、根据峰高或峰面积定量。 2、HPLC与GC的区别 （1）流动相差别 GC用气体做流动相，气体（惰性）与样品分子之间作用力可忽略，而且，载气种类少，性质接近，改变载气对柱效和分离效率影响小。 HPLC以液体做流动相，液体分子与样品分子之间的作用力不能忽略，而且液体种类多，性质差别大，既可以是水溶液，又可以是有机溶剂；既可以是极性化合物，又可以是非极性化合物，可供选择范围广，是控制柱效和分离效率的重要因素之一，使HPLC除了固定相的选择外，增加了一个可供选择的重要的操作参数。 （2）固定相差别 GC固定相多是固体吸附剂或在担体表面上涂渍一层高沸点有机物组成的液体固定相及近年出现的一些化学键合相。GC固定相粒度粗（一般为100～250μm）、吸附等温线多是非线性的，但成本低。 HPLC固定相大都是新型的固体吸附剂，化学键合相等，粒度小（一般为3—10μm ），分配等温线多是线性的，峰形对称，但成本高。样品容量比GC高，分析型色谱柱最大容量可达50mg以上。 （3）使用范围更广 GC一般分析沸点500℃以下，相对分子质量少于450的物质，而对热稳定性差、易于分解、变质及具有生理活性的物质，都不能用升温气化的方法分析。因此， GC只能分析占有机物总数15%～20%的物质。 HPLC茌室温或在接近室温条件下工作，可分析沸点在500℃以上，相对分子质量在450以上的有机物质。这些有机物质占总数的80%～85%。HPLC的使用范围远远超过GC。 （4）原理和结构差别 高效液相色谱仪和气相色谱仪在原理和结构上也有很大差别。 由于液相色谱流动相为液体，比气体黏度高，为了得到合理的柱内线速度及较短的分析时间，高效液相色谱仪设有高压输液系统。 液相色谱中采用更低的柱温，一般可在室温下进行。大多数检测器的检测原理和结构与气相色谱也不同。 高效液相色谱检测器的结构要复杂些，灵敏度低些，检测技术赶不上气相色谱。 从总体上看，高效液相色谱法较之气相色谱法，可分离分析的化合物范围广，但操作系统要复杂得多，分离的成本较高，且检测的灵敏度低些。 二者在使用中具有很好的互补作用，一个基本原则是能使用气相色谱法的，就不用液相色谱法。 三、HPLC的主要类型及其分离原理 高效液相色谱根据溶质在两相间分离过程的物理化学原理不同可分为四种类型： 液-固吸附色谱 液-液分配色谱 离子交换色谱 凝胶色谱。 1、液-固吸附色谱 又称吸附色谱、液-固色谱。 固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯微粒等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的反复吸附与解吸。因为不同的待测组分分子在固定相表面的吸附能力不同，因而吸附—解吸的速度不同，各组分被洗出的时间（保留时间）也就不同，使得各组分彼此分离。 适用性：适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。 2、液-液分配色谱 又称分配色谱、