多种.植物总DNA提取方法及详细步骤.docVIP

植物总DNA提取 一、常用方法 改良CTAB法（改良自精编分子生物学实验指南，原蓝猪耳实验方案，拟采用） 植物基因工程，王关林，2002 SDS法（植物基因工程，王关林，2002） 高盐低pH值法（邹喻萍，植物学报，1994） 材料预处理：℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖。材料预处理：℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖。材料预处理：℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖。材料预处理：℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖。 试剂： 2-巯基乙醇（2-ME） CTAB抽提液 CTAB/ NaCl溶液 24：1（V/V）氯仿/异戊醇 CTAB沉淀液 高盐TE缓冲液 70％乙醇 TE缓冲液 试剂： 2×CTAB提取缓冲液试剂： 提取缓冲液：100mmol/L Tris·Cl（pH8.0）、50mmol/L EDTA（pH8.0）、500 mmol/L NaCl、10 mmol/L 2-巯基乙醇（2-ME） 10% SDS 5mol/L KAC 操作：将冻粉转入2ml离心管中l（980＋20）预热至65℃的CTAB抽提液，于65 ℃温育10~60 min），并经常温和混匀。 放至室温，加入等体积的氯仿异戊24：1）抽提匀浆液，颠倒使充分混合，℃，7 500g（对于小样品，在离心机上以10000 /min）离心1/10体积的65℃的CTAB/Nal溶液，颠倒混匀。氯仿异戊24：1），颠倒使充分混合，℃，7 500g（对于小样品，在离心机上以10000 /min）离心CTAB沉淀液，混匀，如果沉淀可见，继续做，否则于65 ℃温育30 min℃，10000 r/min离心l的高盐TE缓冲液和2μl RNaseA储备液重悬沉淀，于37℃温育30min。 加入2倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀，于4℃, 7 500g（对于小样品，在离心机上以10000 /min）l TE溶解沉淀。 操作： 2ml离心管中加入1ml提取缓冲液，65℃预热。0.2g新鲜幼嫩叶片，于液氮中迅速研磨成粉。将呈干粉状态的研磨物迅速转入提取缓冲液中，尽快混匀，于65℃保温30min。其间轻柔2~3次。取出离心管，冷至室温，加入1ml的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒混匀，静置10min。10 000r/min离心10 min。转移上清液于另一离心管中，加入2/3体积的异丙醇，轻缓颠倒混匀，室温放置15min。10 000r/min离心10 min，去上清液。用2ml 70％乙醇洗涤沉淀次，室温下微干，μl 高盐TE缓冲液 μl的RNase，颠倒混匀，37℃保温h。4℃, 7 500g（对于小样品，在离心机上以10000 /min）l TE溶解沉淀。 操作： 称取样品0.g，去除表面的DNA污染，置于研钵中与液氮共研成细粉。将冻粉转入2ml离心管中，加入提取缓冲液μl（自注：观察此用量合适否），轻轻搅动，使冻粉充分散开。加入400μl 10％SDS，充分混匀，于65℃水浴中保温10～15min（间隔晃动2～3次）。加入640μl 5 mol/L KAC，充分混匀，冰浴中放置30min。4℃ 12 000rpm离心15min。上清液转入新的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒离心管数次，放置。于4℃下8 000rpm离心10min。上清液转入离心管中，加入2/3体积、-20℃预冷的异丙醇，混匀，放置30min，观察DNA沉淀生成。于4℃下8 000rpm离心10min，去上清液。用80％的乙醇洗涤沉淀，10～15min。加入400μl TE缓冲液充分溶解沉淀（若溶解不好，可置37℃水浴中保温，促进溶解）。5 000rpm离心5min，上清液转入新的离心管（去除不溶物）。加入10μl RNaseA溶液（1μg/μl），于37℃温育30min。加入等体积的氯仿/异戊醇，，放置后10 000rpm离心5min，重复一次。转移并量出上清液体积，置新离心管中，加入1/5体积的3 mol/L NaAC，混匀，加入2.5倍体积的无水乙醇，轻缓混匀，室温放置。10 000rpm离心5～10min，去上清。用80％乙醇洗涤沉淀2～3次，。加入50μl 溶解DNA，备用。 称取样品，去除表面的DNA污染，置于研钵中与液氮共研成细粉℃的提取缓冲液，保温30min，并经常温和混匀（自注：观察时间够否，提取液够否）。 在室温下10 000g离心10min。 上清液中加入2/3体积2.5mol/L pH4.8的KAc溶液，0℃放置30min沉淀蛋白质。 10 000g，4℃离心10min。 上清液加入0.6倍体积-20℃预冷的异丙醇-20℃放置30min使核酸充分沉淀。 10 000g离心10min，去上清，将沉淀溶于500μl SDDW中。10 000g离心min，